Influence of glial cells on postnatal differentiation of rat retinal ganglion cells

Abstract

The interplay of neurons and glia cells is highly relevant for many aspects of nervous system development. One important phase is the formation of synapses. Previous studies had shown that soluble glia-derived factors enhance the formation and efficacy of synapses in cultured retinal ganglion cells (RGCs) (Nägler et al., 2001), and identified one of these factors as cholesterol (Mauch et al., 2001). The aim of my project was to investigate how cholesterol supports synapse formation and function and whether other glia derived factors are involved in synaptogenesis in cultured RGCs. In the second part, I was searching for neuronal target genes involved in glia-dependent postnatal differentiation of rat RGCs using GeneChip expression analysis. Searching for the mechanism of glia- and cholesterol-induced synapse formation, I could show by immunostaining with pre- and postsynaptic markers that glia conditioned medium (GCM) and cholesterol enhanced the number of synapses slowly within several days of treatment. Cholesterol induced a smaller but significant increase in synapse number than GCM. Filipin staining, an indicator of the cholesterol content, revealed a ten-fold enhancement in neuritic cholesterol content within 72 hours of GCM and cholesterol treatment but with a strikingly different time course. This indicated that the increase in cholesterol content does not determine the rate of synaptogenesis. Immunostaining of dendrites using a MAP2 antibody revealed that GCM and cholesterol induced dendrite differentiation with a remarkably similar time course as the increase in synapse number. This indicated that dendrite differentiation, which involved a redistribution of MAP2 and GluR2/3 from the somata to dendrites, was the rate limiting step in glia-induced synaptogenesis. Interestingly, I also found that neighboring cells impede dendrite differentiation. Cholesterol was indispensable for dendrite differentiation but less efficient than GCM, which may explain the lower number of synapses in cholesterol- compared to GCM- treated RGCs. I found that glia-derived laminin containing the gamma-1 chain together with cholesterol promoted dendrite differentiation to the same extent then GCM, suggesting that laminin act as dendrite promoting signal for RGCs. Furthermore, using electrophysiological record-ings, I showed by removal of GCM and replacement with cholesterol, that cholesterol is essential for continuous synaptogenesis and for the stability of evoked transmitter release. To detect neuronal genes whose expression is regulated by glia, I performed GeneChip analysis of GCM- and cholesterol-treated RGCs. My experiments revealed several genes whose level of expression changed under the influence of GCM and cholesterol. Interestingly, there was very little overlap between the two groups except for genes involved in cholesterol biosynthesis and homeostasis. To test if the neuronal cholesterol synthesis was influenced by these changes I labeled new synthesized lipids, using a radio-active precursor. I observed that GCM and cholesterol treatment clearly down regulated the cholesterol synthesis in neurons, confirming this expression result. GCM highly up regulated the genes of matrix Gla protein and heme oxygenase 1, which could be confirmed on protein level. Immunostaining revealed that both proteins were located in the somatodendritic compartment. Together, these results revealed new roles of cholesterol and laminin in neuronal differentiation and underline the importance of neuron-glia interactions during brain development.

Für viele Prozesse bei der Entwicklung des Nervensystems ist die Interaktion von Neuronen und Gliazellen wichtig. Eine entscheidende Phase dabei ist die Bildung von Synapsen. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass von Gliazellen sezernierte Faktoren die Bildung und Effizienz von Synapsen in kultivierten retinalen Ganglienzellen (RGZ) erhöhen (Nägler et al., 2001). Einer dieser Faktoren wurde als Cholesterin identifiziert (Mauch et al., 2001). Ziel des ersten Teils meiner Arbeit war es, herauszufinden wie Cholesterin die Synapsenbildung in Kulturen von gereinigten RGZ unterstützt und ob weitere gliale Faktoren dabei involviert sind. Der zweite Teil meiner Arbeit diente der Identifizierung von neuronalen Genen, die bei der postnatalen Differenzierung von RGZ eine Rolle spielen und deren Expression durch Gliazellen beeinflusst wird. Zur Untersuchung der Mechanismen der glia- und cholesterininduzierten Synapsenbildung führte ich zuerst Immunfärbungen mit pre- und postsynaptischen Markern durch. Ich konnte zeigen, dass Glia- konditioniertes Medium (GKM) und Cholesterin die Anzahl der Synapsen innerhalb von mehreren Tagen langsam erhöhen. Die Behandlung mit Cholesterin erzeugte eine signifikante Erhöhung der Synapsenzahl, die jedoch geringer ausfiel als bei GKM-behandelten Zellen. Anschließende Filipin-Färbungen, ein Indikator für den Cholesteringehalt, ergaben nach 72 Stunden GKM- oder Cholesterinbehandlung einen zehnfachen Cholesterinanstieg in RGZ Neuriten. Dieser wurde jedoch über einen deutlich verschiedenen Zeitverlauf erreicht, was den Anstieg des zellulären Cholesteringehalts als Ursache für die verzögerte Synapsenbildung ausschloss. Die Immunfärbung von Dendriten mit einem Antikörper gegen Map2 ergab, dass GKM und Cholesterin die Differenzierung von Dendriten auslösen, und zwar mit genau derselben zeitlichen Verzögerung wie bei der Synapsenbildung. Dieser Umstand zeigte, dass die Differenzierung von Dendriten die gliainduzierte Synapsenbildung verzögerte und ging einher mit der Umverteilung von Map2 und GluR2/3 vom Soma zu den Dendriten. Weitergehende Untersuchungen ergaben, dass Nachbarzellen die Dendritendifferenzierung behindern. Cholesterin war unentbehrlich für die Dendritendifferenzierung, aber von geringerer Wirkung als GKM, was die kleinere Anzahl der Synapsen bei Cholesterinbehandlung im Vergleich zur GKM-Behandlung erklären könnte. Weitere Untersuchungen ergaben, dass Laminin, welches in GKM enthalten ist, über seine gamma-1 Untereinheit die Dendritendifferenzierung unterstützte und zusammen mit Cholesterin dieselbe Wirkung erzielte wie GKM. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Laminin bei RGZ als Signal für die Dendritendifferenzierung wirkt. Mit Hilfe von elektrophysiologischen Messungen und der Wegnahme von GKM sowie dessen Ersatz durch Cholesterin, konnte ich zeigen das Cholesterin essentiell ist für die Fortdauer der Synapsenbildung und die Stabilität von evozierter Transmitterausschüttung. Um neuronale Gene, deren Expression durch Gliazellen reguliert wird, zu identifizieren, verglich ich die Expressionsmuster von unbehandelten RGZ mit denen von GKM- oder cholesterinbehandelten. Hierfür benutzte ich GeneChips. Diese Untersuchungen ergaben mehrere Gene, deren Expression sich unter dem Einfluss von GKM oder Cholesterin änderte. Interessanterweise gab es nur wenige Überschneidungen zwischen den beiden Gruppen, mit Ausnahme von Genen die Funktionen in der Cholesterinsynthese und Homeostase ausüben. Um zu untersuchen, ob die Veränderung der Genexpression die neuronale Cholesterinsynthese beeinflusst, markierte ich neu synthetisierte Lipide mit Hilfe eines radioaktiven Vorläufers. Die Ergebnisse bestätigten die Expressionsanalyse und zeigten, dass GKM und Cholesterin die Cholesterinsynthese in RGZ deutlich verringerten. Weiterhin ergab die Behandlung mit GKM eine Erhöhung der Expression des Matrix Gla Proteins und der Heme Oxygenase 1, was auf Proteinebene bestätigt wurde. Immunfärbungen lokalisierten beide Proteine in Somata und Dendriten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten neue Funktionen für Cholesterin und Laminin bei der neuronalen Differenzierung auf und lieferten weitere Beweise für die Bedeutung der Interaktionen zwischen Neuronen und Gliazellen während der Entwicklung des Nervensystems.