Oberflächenmodifizierung von Mikropartikeln aus Poly(dl‑milchsäure-co- glycolsäure) mit Toll‑like‑Rezeptor‑Agonisten – Wirkung auf Antigen- präsentierende Zellen

Abstract

Innerhalb dieser Arbeit wurden Mikropartikel aus dem bioabbaubaren Polymer Poly(dl-milchsäure-co-glycolsäure) (PLGA‑MP) als Antigen-Trägersystem für Antigen-präsentierende Zellen (APC) – z. B. Makrophagen und Dendritische Zellen (DC) – entwickelt. Ziel war eine verbesserte Immunantwort gegenüber Tumorantigenen im Rahmen einer DC-Immuntherapie. Hierfür wurden aus Monozyten gewonnene humane DC (huMoDC) eingesetzt. Die PLGA‑MP sollten den Transport des Modell-Antigens bovines Serumalbumin (BSA) in die APC und deren zeitgleiche Reifung vermitteln, um eine effektive Antigenpräsentation und Aktivierung von antigenspezifischen T‑Zellen zu bewerkstelligen. Da BSA-beladene PLGA‑MP alleine keine Reifung der APC verursachten, wurden diese mit Reifungsstimuli aus der Gruppe der Toll-like-Rezeptor-(TLR-)Agonisten modifiziert. Hierfür wurden synthetische Analoga, konkret die synthetischen Lipopeptide BAS (TLR2/1-Agonist) und FSL1 (TLR2/6‑Agonist) sowie das detoxifizierte LPS- Derivat sMPLA (TLR4‑Agonist), an die PLGA‑MP assoziiert und deren Wirkung auf APC bestimmt. Mittels einer W/O/W-Doppelemulsions-Lösungsmittel-Evaporations- Methode konnten PLGA‑MP mit einem volumetrischen Teilchendurchmesser von ca. vier Mikrometern hergestellt werden, die effektiv von makrophagenartigen THP-1-Zellen und huMoDC phagozytiert wurden. Das Modell-Antigen BSA wurde effizient verkapselt und schnell freigesetzt. Die PLGA‑MP zeigten eine heterogene, vorwiegend oberflächennahe Proteinverteilung und wiesen eine glatte Oberfläche mit einer einzelnen porenartigen Vertiefung auf. Der Restlösungsmittelgehalt war ca. 550mal geringer als die vom europäischen Arzneibuch geforderte Grenzkonzentration. Der geringe Endotoxin-Gehalt von unter 0,015 EU/mg beeinflusste die untersuchten Zellen nicht nachteilig. Die synthetischen Lipopeptide konnten sowohl kovalent, mit Hilfe einer Carbodiimid-Methode, als auch adsorptiv an die Oberfläche der PLGA‑MP assoziiert werden. Sie führten zu einer TLR2-vermittelten Aktivierung von THP-1-Zellen, die anhand der TNFα- und IL6-Ausschüttung gemessen wurde. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass partikelassoziierte Lipopeptide eine deutlich stärkere Aktivierung bewirken als gelöste Lipopeptide, was auf eine Stimulation von intrazellulären TLR2 nach der Phagozytose der PLGA‑MP zurückgeführt wurde. Die Lipopeptid-modifizierten PLGA-MP führten zu einer marginalen Reifung und TH1-Polarisierung von huMoDC und waren nicht zytotoxisch. Die Reifung der behandelten huMoDC war jedoch durch eine Sekundärstimulation mit LPS R60 und IFNγ induzierbar. Für die Modifizierung von PLGA-MP mit sMPLA wurden zunächst positiv geladene PLGA-MP durch Beschichtung mit dem Polykation Protamin hergestellt. An deren Oberfläche wurde anionisches sMPLA über elektrostatische Wechselwirkungen assoziiert. Die sMPLA-modifizierten PLGA‑MP waren nicht zytotoxisch und führten zu einer gesteigerten Expression von MHC-II- und kostimulatorischen Molekülen. Zusätzlich wurde die Ausschüttung des TH1-polarisierenden Zytokins IL12p70 erhöht. Damit wiesen die huMoDC die wesentlichen Parameter auf, welche für die Induktion einer gegen den Tumor gerichteten TH1-Immunantwort nötig sind. Daher sind die entwickelten sMPLA-modifizierten PLGA‑MP ein geeignetes bifunktionales Trägersystem, welches den Transport der Antigene in die huMoDC und die gleichzeitige Reifung der DC-Vakzine vermittelt.

In the present study microparticles composed of the biodegradable polymer poly (dl-lactic-co-glycolic acid) (PLGA‑MP) were developed as an antigen delivery system for antigen-presenting cells (APC), such as macrophages or dendritic cells. The aim was to improve the immune response against tumor antigens within the scope of a dendritic cell-based immune therapy. Therefore human monocyte-derived dendritic cells (huMoDC) were applied. PLGA‑MP should simultaneously carry the modell antigen termed bovine serum albumin (BSA) into the APC and mature them as to accomplish an effective antigen-presentation and activation of antigen-specific T-cells. Since BSA-loaded PLGA‑MP alone did not induce maturation of dendritic cells, they were modified with maturation stimuli, i. e. Toll-like receptor (TLR) agonists. For this purpose we used synthetic analogues, in particular the synthetic lipopeptides BAS (TLR2/1 agonist) and FSL1 (TLR2/6 agonist) as well as the detoxified LPS derivat sMPLA (TLR4 agonist). The TLR agonists were associated with the PLGA‑MP and the effect on APC was determined. PLGA‑MP were prepared by using a w/o/w-double emulsion solvent evaporation technique. They exhibited a volumetric particle diameter of approximately four micrometers and were effectively phagocytised by macrophage-like THP-1 cells and huMoDC. The model antigen BSA was efficient encapsulated and released fast. The PLGA-MP showed a heterogeneous protein distribution and most of the proteins were localized near the surface beeing smooth with a single pore-like cavity. The residual solvent content was approximately 550 times below the allowed limit concentration set up by the European Pharmacopoeia. The low endotoxin content of less than 0.015 EU/mg did not adversely influence the investigated cells. Besides the adsorption of the synthetic lipopeptides to the surface of the PLGA-MP, a covalent linkage using a carbodiimide method was applied. The lipopeptides induced a TLR2-mediated activation of THP-1 cells, as measured by the intensity of TNFα and IL6 secretion. For the first time it could be shown that particle-associated lipopeptides caused a much stronger activation as dissolved lipopeptides. This effect was attributed to a stimulation of intracellular TLR2 after phagocytosis of the PLGA-MP. The lipopeptide-modified PLGA-MP did not prove cytotoxic and induced a marginal maturation as well as a TH1 polarization of huMoDC. The maturation of the treated huMoDC could be improved by a secondary stimulation using LPS R60 and IFNγ. To modify PLGA-MP with sMPLA, first positively charged PLGA‑MP were prepared by coating them with the polycation protamine. In a second step anionic sMPLA was attached primarily by electrostatic interactions on the surface. The sMPLA-modified PLGA‑MP did not prove cytotoxic and led to an increased expression of MHC-II and costimulatory molecules. In addition, the release of TH1-polarizing cytokine IL12p70 was increased. Thus, the huMoDC had shown the essential parameters, which are necessary for the induction of an anti-tumor TH1 immune response. Therefore, sMPLA-modified PLGA-MP definitely serve as suitable bifunctional carriers, which simultaneously mediate the transport of antigens inside the huMoDC and the maturation of the DC vaccine.