Biokeramische Scaffolds für die in vitro und in vivo Chondrogenese von mesenchymalen Stromazellen

Abstract

Einleitung: Aufgrund der physiologisch eingeschränkten Regeneration des bradytrophen hyalinen Gelenkknorpels, kann es durch Überforderung des Reparaturmechanismus zu dauerhaften Knorpeldefekten kommen. Verletzungen des artikulären hyalinen Knorpels verlangen von den ohnehin schon in geringer Zahl im Gelenkknorpel vorhandenen Chondrozyten eine außerordentlich hohe Syntheseleistung für die Wiederherstellung der Extrazellulärmatrix. Auch aus diesem Grund nimmt neben pharmakologischen Verfahren das Tissue engineering heute eine wichtige Position im Hinblick auf die Heilungsaussicht von Knorpeldefekten ein. In Hinblick auf eine mögliche Anwendung von Biomaterial- assoziierten dreidimensionalen (3D) Kultursystemen zur Behandlung osteochondraler Defekte wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von vier biokeramischen Ca-Zn-Scaffoldvarianten auf die Chondrogenese von porcinen atikulären Knorpelzellen und mesenchymalen Stromazellen (MSC) in einem geblindeten Versuch analysiert. Methode: Die synthetischen 3D Matrices wurden mit porcinen Gelenkchondrozyten (PGC) und MSC besiedelt und kultiviert. Dabei erfolgte die Analyse und ein Vergleich der Besiedlungseffizienz zwischen den aufgeführten Zellarten, die mithilfe der invertmikroskopischen Aufnahme der beiden Besiedlungen an definierten Tagen registriert werden konnten. Zudem wurde ein Vitalitätsassay durchgeführt, um lebende und tote Zellen zu detektieren. Um eine stattgefundene Chondrogenese der zu differenzierenden MSC zu untersuchen, wurde die Immunfluoreszenzfärbung des gelenkknorpelspezifischen Makromoleküles Kollagen Typ II, F-Aktin und des Dedifferenzierungsmarkers Kollagen Typ I durchgeführt. Um das Verhalten der Zell-Matrix-Konstrukte auch in vivo aufzuzeigen, wurden chondrogen differenzierte Besiedlungen und als Kontrolle unbesiedelte Scaffolds in Nacktmäuse implantiert und nach Explantation mithilfe makroskopischer und histologischer Scoresysteme bewertet. Das Nacktmausmodell diente auch zur Detektierung möglicherweise stattgefundener systemischer Entzündungsreaktionen oder Neoplasiebildungen durch die besiedelten und unbesiedelten Scaffolds. Ergebnis: Die Hellfeldaufnahmen der chondrogen differenzierten MSC- Besiedlungen zeigten eine signifikant bessere Adhärenz als die PGC- Besiedlungen, jedoch waren hierbei keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Scaffoldvarianten zu registrieren. Im Vitalitätsassay konnte in den PGC-Besiedlungen wenig bis kaum grün gefärbtes Zytoplasma von vitalen Zellen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurden in den chondrogen differenzierten Besiedlungen viele lebende und nur wenig tote Zellen in allen Scaffoldvarianten beobachtet. Immunhistochemisch wurde eine geringe Kollagen Typ II Exression in den MSC-Besiedlungen nachgewiesen. Im in vivo Nacktmausmodell wurde anhand des histologischen Scoresystems die höchste Punktzahl für Scaffold D sowohl in der besiedelten als auch unbesiedelten Gruppe ermittelt. Schlussfolgerung: Letztlich reichten die gewonnenen Daten nicht aus, um eine abschließende Bewertung, welche von den vier Scaffoldvarianten die besseren Eigenschaften hinsichtlich der Zellkultivierung, Produktion von knorpelspezifischen Markern und Biokompatibilität aufwies, vorzunehmen. Um eine eindeutige Aussage zur Eignung der Scaffolds im Bereich des Tissue engineerings zu machen, müssten weitere Untersuchungen erfolgen.

Introduction: Due to the hyporegenerative metabolism of cartilaginous tissue, which limits its capability to self-regenerate, degenerative diseases and traumatic injury associated with the cartilage could result in permanent cartilage defects. Moreover, cartilage engineering approaches are gaining more and more importance alongside pharmaceutical and common surgical methods. In the present work, cell adherence, chondrogenic potential, biocompatibility, etc. of four scaffolds (A-D) has been assessed in vitro and in vivo, in combination with porcine articular cells (PGC) and human mesenchymal stem cells (MSC) in a blinded experiment. The aim of the present work was to assess the influence of novel bioceramic scaffold variants on chondrogenesis of porcine articular chondrocytes and human mesenchymal stem cells. Methods: The scaffolds (A-D) were seeded with PGC and MSC using dynamic and static culturing procedures. Cell adherence was measured in a semiquantitative manner between PGC and MSC using the brightfield microscope at specific dates. Vital staining was performed to detect living and dead cells. The chondrogenic commitment of the MSC was monitored by detecting the cartilage distinctive marker (collagen type II) using immunofluorescence labeling. The nude mice xenograft model was performed in order to assess the quality of tissue- engineered cartilage produced by differentiated MSC seeded on the scaffolds A-D in vivo. Scaffold associated inflammations and neoplastic alterations in certain organs such as the spleen, liver, kidney and brain of the nude mice should be revealed through HE-staining. Results: The MSC attached significantly more to the scaffolds than the PGC. Vitality staining showed significantly higher numbers of vital cells in the MSC-group. Lower collagen type II expression was observed in contrast to collagen type I in all MSC- groups. No significant differences were detected between the scaffolds "A-D". Scaffold D achieved the highest overall score in the in vivo experiment. Conclusion: Further exploration has to be made to recommend the use of the investigated scaffolds and the development of a novel medical device that could be beneficial for the treatment of cartilage defects and thus improving the efficiency of current therapeutic options.