Functional Analysis of the Murine LI-Cadherin Promoter

Abstract

The LI-cadherin (cadherin-17) is a structurally divergent member of the cadherin superfamily, with seven rather than five extracellular cadherin repeats, exclusively expressed in the small and large intestine but not in the upper gastric tract. Although lacking from the healthy gastric epithelia, LI- cadherin becomes strongly expressed during intestinal metaplasia and in gastric adenocarcinomas. In this thesis, the first analysis of the mechanisms regulating murine and human LI-cadherin expression was performed. The transcriptional start site was identified by 5'-RACE and primer extension analysis. Activity of 2.8 kb of the 5'-flanking region was tested with luciferase reporter gene constructs in gastrointestinal cell lines. A comparison of the human and murine 5'-flanking region revealed putative binding sites for the transcription factors Cdx2, HNF-1, AP-1, Sp1 and GATA-1, 2, 3.. The Cdx2 and HNF-1 binding sites were both conserved in mouse and human, while the GC-box was only found in the murine 5'-flanking region. Deletion analysis was used to identify regions of the LI-cadherin promoter required for activity in transfected intestinal cells. The results indicated that promoter activity was dependent on positive regulatory elements located within only 55 nucleotides directly upstream of the transcriptional start site. EMSA and supershift assays identified the hepatocyte nuclear factor HNF-1 and Sp1 as interacting factors within this region. Further upstream, the intestine-specific homeodomain protein Cdx2 was found to interact with the promoter. Mutational analysis demonstrated a positive regulatory role for HNF-1 and Cdx2. While the GC-box was lacking in the human sequence, function in mouse was indicated through mutational analysis of the murine GC-box in reporter gene assays.

LI-Cadherin (Cadherin 17) ist ein Mitglied der Cadherin-Superfamilie mit einigen strukturellen Besonderheiten. Im Gegensatz zu klassischen Cadherinen besitzt es sieben anstelle von fünf extrazellulären Cadherin-Homologiedomänen und einen kurzen, 20 Aminosäuren umfassenden, zytoplasmatischen Anteil. Es zeigt ein spezifisches Expressionsmuster in den Enterozyten aller Darmabschnitte und wird darüber hinaus ektopisch bei der intestinalen Metaplasie des Magens exprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der Regulationsmechanismus der humanen und murinen LI-Cadherin-Expression analysiert. Der Transkriptionsstartpunkt konnte mittels 5'-RACE und mit der Methode der Primer-Extension ermittelt werden. Des weiteren wurde die Promotor-Aktivität der 2,8 kb umfassenden 5'-flankierenden Region durch Luziferase-Reporterassays in gastrointestinalen Zellinien untersucht. Durch eine in silico Analyse dieser Region konnten potentielle Transkriptionsfaktor- bindungsstellen für Cdx2, HNF-1, AP-1, Sp1 und GATA-1, -2, -3 gefunden werden. Sukzessive Deletionen der 5'-flankierenden Region des LI-Cadherin grenzten einen minimalen Bereich mit Promotoraktivität in intestinalen Zellinien ein. Dieser umfasste die ersten 55 bp 5' vom Transkriptionsstartpunkt und enthielt die Bindungsstellen für Sp1 und HNF-1. Mittels EMSA und Supershift-Assays wurden Sp1 und HNF-1 als tatsächlich mit der 5'-flankierenden Region interagierende Faktoren identifiziert. Zwei Bindungsstellen für Cdx2, einem Darm-spezifischen Transkriptionsfaktor, befinden sich zusätzlich stromaufwärts der 55 bp-Region. Es konnte gezeigt werden, dass Cdx2 nur mit der distalen Bindungsstelle interagiert. Durch Mutationsanalyse der HNF-1- und Cdx2-Bindungsstellen wurde eine positive Regulation der Expression durch HNF-1 und Cdx2 nachgewiesen. Auch eine Mutation der GC-Box war in der Lage, die Promotor-Aktivität zu reduzieren.