Regulation und Bedeutung von Origin recognition complex subunit 1 (Orc1) für den Zelltod isolierter Neurone nach kombiniertem Sauerstoff- und Glukoseentzug, einem Zellkulturmodell des ischämischen Schlaganfalls

Abstract

Der origin recognition complex ORC, bestehend aus den Untereinheiten ORC1-ORC6, leitet als Prä-Initiationskomplex in proliferierenden Zellen die Synthese-Phase der DNA ein (S-Phase). Die Assemblierung von ORC1 an den Kernkomplex - bestehend aus ORC2-5 - wird zellzyklusabhängig reguliert. ORC1 gilt als regulatorische Untereinheit des Komplexes und vermittelt dessen Bindung zum Chromatin. Somit ist es essentiell für die Initiation der S-Phase. Orc1 selbst wird zellzyklusabhängig durch die Transkriptionsfaktoren der E2F- Familie reguliert. In differenzierten Neuronen wird Orc1 im Gegensatz zu den Untereinheiten Orc2-6 unter physiologischen Bedingungen sehr gering exprimiert. Der reprimierende Transkriptionsfaktor E2F4 scheint in solchen maturen Nervenzellen unter anderem durch eine Zellteilungsblockade eine Funktion in der Aufrechterhaltung des differenzierten Status zu haben. Neurone werden daher als post-mitotisch bezeichnet. Unter pathophysiologischen Bedingungen wie z.B. nach zerebraler Ischämie/Hypoxie hat ein aberranter Zellzykluseintritt den neuronalen Zelltod zur Folge. In dieser Arbeit wurde die Rolle von ORC1 und dessen transkriptionelle Regulation durch den E2F4-Repressorkomplex im Kontext des neuronalen Zelltodes im Zellkulturmodell für die zerebrale Ischämie untersucht. In Zellkultur (in vitro) wurde der Schaden durch einen transienten Sauerstoff- und Glukoseentzug (oxygen glucose deprivation: OGD) modelliert. Orc1 wurde nach OGD in Neuronen transkriptionell aktiviert. Dabei war die Regulation abhängig von einem Verlust des reprimierenden Transkriptionsfaktors E2F4 am Orc1 Promotor. Wurde die Orc1 Expression nach kombinierten Sauerstoff- und Glukoseentzug durch lentiviral vermittelte RNA Interferenz mit Orc1 in Neuronen gehemmt, schützte dies vor neuronalem Zelltod. ORC1 ist als Schlüsselprotein und dessen Regulation durch den reprimierenden Transkriptionsfaktor E2F4 als ein molekularer Mechanismus zur Initiation neuronalen Zelltods nach OGD identifiziert worden.

In proliferating cells the origin recognition complex ORC, that is comprised of the subunits ORC1-ORC6, serves as a pre-initiation complex to induce DNA synthesis (S-phase). ORC1 assembly to the ORC core complex (subunits ORC2-5) regulates the ORC in a cell cycle dependent manner. ORC1 assembly is required to mediate binding to chromatin and is the rate limiting step for the initiation of S-phase. Orc1 is identified as a target gene of the cell cycle controlling E2F transcription factor family. ORC1 is virtually absent in mature neurons under physiological conditions in contrast to the constitutively expressed subunits ORC2-6. The repressive transcriptionfactor E2F4 seems to take part in the inhibition of cell cycle progression and maintains the differentiated state of neurons. Thus, neurons are entitled post-mitotic. Aberrant cell cycle reentry after brain ischemia or other pathophysiological conditions is implicated in neuronal cell death. In this study the role of ORC1 and its regulation by the repressive E2F4 complex in neuronal cell death after brain ischemia is explored. Orc1 was transcriptionally upregulated after hypoxic damage, which was induced by combined oxygen glucose deprivation (OGD) of mouse primary cortical neurons. Orc1 was regulated by the repressive transcriptionfactor E2F4. Inhibition of Orc1 de novo transcription by neuronal-specific RNA interference with Orc1 protected neurons against cell death induced by OGD. This study identified ORC1 as a novel rate limiting factor und its regulation through E2F4 as a molecular mechanism involved in neuronal cell death after oxygen glucose deprivation.