Isolation und phänotypische Charakterisierung von Immunzellen aus humanen mukosalen Lymphfollikeln

Abstract

Immunologische Mechanismen oraler Toleranz sind beim Menschen bislang nur unzureichend bekannt. Funktionelle Untersuchungen mukosaler Lymphfollikel beschränken sich hauptsächlich auf murine Modelle. Die Untersuchung humaner Lymphfollikelzellen wird dadurch erschwert, dass Peyersche Plaques und Lymphfollikel beim Erwachsenen endoskopisch nicht zu identifizieren sind und es bisher nicht möglich war, die Lymphozyten der Follikel getrennt aufzuarbeiten und zu analysieren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung einer Methode zur gezielten Isolation von Lymphozyten aus humanen Peyerschen Plaques des Ileums und Lymphfollikeln des Kolons/Rektums. In Biopsien des terminalen Ileums und Resektaten des Kolons konnten unter dem Stereomikroskop Peyersche Plaques und Lymphfollikel eindeutig identifiziert und präpariert werden. Nach enzymatischer Lösung des Zellverbandes wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation mononukleäre Zellen aus Lymphfollikeln und benachbarter Lamina propria getrennt isoliert. Es wurden 8-fach-Färbungen für die Multi-Parameter-Durchflusszytometrie etabliert, die detaillierte phänotypische Analysen bereits bei einer Zellzahl von circa 100000 Zellen ermöglichten. Neun Patientenproben aus dem terminalen Ileum und acht Proben aus Kolon/Rektum wurden phänotypisch charakterisiert. Der Anteil von T-, B- und Plasmazellen in den isolierten Zellpopulationen entsprach der durch immunhistochemische Untersuchungen bekannten Zusammensetzung mononukleärer Zellen in Lamina propria und Lymphfollikeln. Dendritische Zellen und Makrophagen konnten nicht isoliert werden. Der relative Anteil von T-Lymphozyten unterschied sich nicht zwischen isolierten mononukleären Zellen aus Lymphfollikeln und Lamina propria. Hingegen fand sich in Übereinstimmung mit immunhistochemischen Daten ein höherer Anteil von B-Lymphozyten in den Lymphfollikeln im Vergleich zur Lamina propria [42% vs. 22%]. Der Anteil der Plasmazellen an den Lamina-propria-Leukozyten betrug 5%, die Zahl der follikulären Plasmazellen war mit 2% signifikant geringer. Diese Unterschiede bestätigen die getrennte Isolation der beiden Zellpopulationen aus Follikeln und Lamina propria. Innerhalb der T-Zellpopulation fanden sich in den Follikeln erwartungsgemäß weniger aEb7-positive T-Zellen und mehr L-Selektin- positive T-Zellen auf als in der Lamina propria. Des weiteren fanden sich unter den Lymphfollikel-Lymphozyten mit 61% mehr CD4-positive T-Zellen und mit 12% weniger CD8-positive T-Zellen als in der Lamina propria, die 49% CD4-Zellen und 18% CD8-Zellen enthielt. Die T-Lymphozyten der Lamina propria waren häufiger CD69-positiv als die T-Zellen der Follikel. Der Vergleich zwischen Lymphfollikel-Leukozyten aus Ileum und Kolon ergab eine weitgehend ähnliche Zusammensetzung der isolierten Zellen. Es ist in dieser Arbeit gelungen, eine Methode zu etablieren, mit der eine gezielte Präparation von Peyerschen Plaques und von Lymphfollikeln möglich ist. Die isolierte Zellzahl ist gering, aber ausreichend für weiterführende funktionelle und phänotypische Untersuchungen. Langfristig gesehen ist diese Methode ein erster Schritt auf dem Weg zur Aufklärung der an tolerogenen Immunantworten beteiligten Mechanismen. Sie kann somit der Entwicklung und Optimierung von Verfahren zur gezielten Immunmodulation dienen.

Immunological mechanisms of oral tolerance in humans are not very well investigated so far. Functional analysis of mucosal lymphoid follicles is mainly restricted to murine models because analysis of human lymphoid follicles is difficult due to the fact that follicles can not be identified during endoscopy. The aim of this work was therefore to establish a method to isolate lymphocytes from human Peyer s patches and colonic lymphoid follicles. Mucosal lymphoid follicles could be clearly identified under the stereo microscope both in ileal biopsies and in colonic specimens. Mononuclear cells were isolated from excised lymphoid follicles and adjacent lamina propria by means of enzyme digestion and density gradient centrifugation. 8 colors staining for multiplex flow cytometry were established. This allows detailed phenotypical analysis even with cell numbers of about 100,000 cells. 9 ileal samples and 8 colonic samples were characterized. The composition of the isolated cell population from follicles and lamina propria corresponded with known immunhistochemical data. T cells were similarly predominant, but B cells were more and plasma cells less frequent in lymphoid follicles mononuclear cells (LFMC) compared to lamina propria mononuclear cells (LPMC). These differences confirm the separated isolation of both cell populations. T cells from mucosal follicles were more frequently CD4-positive and CD62L-positive, but less frequently CD8-positive, CD103-positive and CD69-positive than lamina propria T cells. LFMC from ileum compared to colon showed no differences in mononuclear cell composition. However, the proportion of T cells expressing CD103 was reduced, and the proportion of T cells expressing CD69 was increased in colon compared to ileum LFMC. That means in conclusion that mucosal follicles can be clearly identified in adult human ileum and colon and yield viable immune cells sufficient for phenotypical analysis.