Anti-Tumor Effekte von anti-T-Zell Globulin (ATG): Welchen Einfluss hat ATG Fresenius auf die antikörperanhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) gegen hämatopoietische Tumoren? Löst ATG Apoptose bei Tumorzellen aus?

Abstract

Die allogene hämatopoietische Stammzelltransplantation (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT) ist eine etablierte Therapie für eine Vielzahl hämatopoietischer Erkrankungen. Es ist aktuell ein Standardverfahren, die im Transplantat enthaltenen T-Zellen des Spenders zu depletieren, da sie hauptverantwortlich für die Entwicklung der Graft-versus-Host-Disease (GVHD) sind. Es bestehen prinzipiell zwei Möglichkeiten zur Depletion von T-Zellen: In vitro durch Manipulation des Transplantats und in vivo, z.B. durch Gabe des polyklonalen Antikörpers Anti-T-Zell Globulin (ATG). Klinische Daten zeigen eine vergleichbare Effektivität der beiden Ansätze zur Verhinderung der GVHD. Allerdings zeigte die in vitro T-Zell-Depletion eine erhöhte Tumorrezidivrate, die nach in vivo T-Zell-Depletion nicht auftrat. Diese Daten bilden die Grundlage für die Haupthypothese dieser Arbeit: „ATG hat anti-Tumor Effekte“. Ich habe den CD107a Assay und den Apoptose Annexin V Assay, die beide auf Durchflusszytometrie basiert sind, angewendet. Ich arbeite mit lebenden Tumorzellen verschiedener hämatologischer Erkrankungen, die mit PBMCs (peripheral blood mononuclear cell, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) zusammen inkubiert werden. Beim CD107a Assay wird die NK-Zell (Natürliche Killerzellen) Degranulation als Marker der gesteigerten ADCC (antibody- dependent cellular cytotoxicity, Antikörper-induzierte zelluläre Zytotoxizität) gemessen. Die Expression von Annexin V zeigt den Einfluss von ATG auf die Apoptose und die komplement-unabhängige Zytotoxizität auf. ATG löst bei NK-Zellen im Beisein von unterschiedlichen Tumorzellen in allen getesteten Dosierungen eine gesteigerte Degranulation und damit auch eine verstärkte ADCC aus. Der Einfluss von ATG auf die Apoptoseinduktion bei Tumorzellen ist ebenfalls deutlich. Die Tumorzellen zeigen einen signifikanten Anstieg des Annexin V, der auf eine ATG induzierte Apoptose hinweist. Meine Ergebnisse zeigen, dass ATG anti-Tumor Effekte vermittelt. Sie liefern eine mögliche Erklärung für die relativ geringe Leukämierezidivrate nach allo-HSCT mit in vivo T-Zell Depletion. Die Bindung von ATG an Tumorzellen ist durch den Herstellungsvorgang erklärt: Kanninchen werden mit einer humanen T-Zell- Lymphom Linie beimpft, die auch verschiedene Antigene exprimiert. Meine Daten haben Implikationen für zukünftige Therapieansätze bei der allo-HSCT, vor allem in Situationen, wo eine T-Zell-Depletion bei einer erhöhten Tumorrezidivgefahr eingesetzt wird.

The allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is an established therapy for a multitude of diseases, mainly haematologic malignancies. This thesis investigates a complication of that therapy, the Graft-versus-Host-disease (GVHD) and one of its different possible medical treatments, the polyclonal antibody anti-thymocyte globulin (ATG). In clincal use, it is a standard procedure to deplete the graft of its T-cell, for they are one of the main effectors for the development of GVHD. In principle, there are two possibilities for the depletion of T-cells: In vitro through manipulation of the graft itself or in vivo, for example through the administration of ATG. Clinical data show that both approaches are similarly effective in order to prevent GVHD. However, the in vitro T-cell depletion showed a significantly increased tumor relapse rate which did not occur with the in vivo T-cell depletion. Those data are the basis for the main hypothesis of my work: „ATG has anti-tumor effects.“ I occupy myself mostly with flowcytometric methods and apply two different assays, the CD107a and the apoptosis Annexin V assay. I work with living tumor cells of a variety of hematological malignancies that are conincubated with PBMCs and analysed. During the CD107a assay, the NK-cell (natural killer cell) degranulation is measured as a marker for an increase of ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity). The expression of Annexin V on tumor cells shows the impact of ATG on apoptosis and therefore on the complement-independent cytotoxicity. ATG induces an increase of the degranulation of NK-cells and thus an enhanced ADCC in the presence of various tumor cells. The influence of ATG on the induction of apoptosis in tumor cells is equally distinct. All tumor cells show a strong rise of Annexin V lest they are incubated only with ATG, which indicates the ATG-induced apoptosis. My results about the antitumor effects of ATG, shown through the experiments with ADCC and the induction of apoptosis, contribute to an improved understanding of the immunologic processes in the early phase after alloHSCT. They provide a possible explanation for the relatively low leukemia relapse rate after allo-HSCT with in vivo T-cell depletion. The binding of ATG to tumor cells can be explained with the manufacturing method: Rabbits are inoculated with a human T-cell-lymphoma line, which expresses a variety of antigens. My findings could potentially influence future therapeutical approaches concerning the allo-HSCT, especially in situations where a depletion of T-cells is required but tumor relapse is a major concern.