Untersuchungen zur Bildung von Vitamin K 2 durch die Intestinalflora des Hundes

Abstract

Vitamin K kommt in zwei unterschiedlichen Formen vor. Vitamin K1, Phyllochinon (PK), ist in grünblättrigen Pflanzen und verschiedenen Pflanzenölen vorzufinden. Vitamin K2, Menachinon (MK), wird im Intestinaltrakt von Säugetieren und Vögeln von der dort ansässigen Darmflora gebildet. Die Menachinone unterscheiden sich in der Länge ihrer Seitenkette und werden je nach Anzahl der Isopreneinheiten numerisch gekennzeichnet (MK-n). Ziel dieser Arbeit war es, die Bildung von MK durch die Intestinalflora von Hunden und den Einfluss von Substraten (Protein und Stärke) anhand von zwei In-vitro-Methoden zu untersuchen. Ergänzend wurde bei Hunden die MK-Konzentration im Chymus verschiedener Darmabschnitte (Duodenum, Jejunum, Ileum, Zäkum und Kolon) bestimmt (Analyse von Ex-vivo-Proben). Zunächst wurden zwei In-vitro-Systeme, eine als semikontinuierliche Langzeitinkubation und eine 24stündige Kurzzeitinkubation auf ihre Eignung als methodischer Ansatz für die Fragestellung getestet. Aufgrund der Ergebnisse der Vorversuche wurde die 24stündige Kurzzeitinkubation als geeignete Methode ausgewählt. Es wurden drei Versuchdurchgänge mit jeweils zehn gasdicht verschlossenen Inkubationsgefäßen durchgeführt. Als Inkubationsansatz diente Fäzes von Hunden, welche mit einem anaeroben vorreduzierten Puffer verdünnt (1:100) wurde. Um den Einfluss von Proteinen und Kohlenhydraten auf die Bildung von MK zu überprüfen, wurde pro Versuchsdurchgang jeweils verschiedene Konzentrationen (0,1, 0,5 und 1,0 g) von Maisstärke (Ms), Fleischpepton (Pep) bzw. Maisstärke/Fleischpepton (Ms/Pep; 50:50) hinzugefügt. Als Kontrolle diente eine Inkubationseinheit ohne Substrat. Alle Gefäße wurden für 24 Stunden, bei 37 °C und bei leichter Rotation unter Lichtschutz inkubiert. Nach Ende der Inkubationszeit wurde der pH-Wert gemessen und Proben für die Bestimmung von flüchtigen Fettsäuren, Ammonium und Laktat als Fermentationsparameter sowie für die Vitamin K Analyse per Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) entnommen. Die Bestimmungen von MK-4 bis -10 ergaben, dass MK-10 das Verteilungsmuster dominierte, gefolgt von MK-9 und MK-4. Am geringsten war die Bildung von MK-7. Ein Einfluss der Substrate war sowohl bei der Gesamtkonzentration als auch bei der Bildung der einzelnen MK zu erkennen. Es zeigte sich, dass die höchsten Konzentrationen von MK-7 bis -10 nach der Zugabe von MS bzw. Ms/Pep gemessen werden konnten und MK-5 und -6 nach dem Zusatz von Ms/Pep. Nach Zugabe von Pep waren die höchsten Konzentrationen von MK-4 zu beobachten. Die Analyse der Digestaproben ergab ein ähnliches Verteilungsmuster. Im Zäkum und Kolon dominierte MK-10, gefolgt von MK-6, -9 und -4. In den Dünndarmproben wurde mehr MK-9 als MK-10 gemessen. Die höchsten Gesamtkonzentrationen wurden im Zäkum (635 ng/g) und Kolon (1045 ng/g) analysiert. Im Dünndarm nahmen die Konzentrationen vom Duodenum zum Ileum ab. Die durchschnittliche Gesamtkonzentrationen der Kurzzeitinkubation und im Koloninhalt ergaben vergleichbare Werte, allerdings muss beachtet werden, dass bei den In-vitro- Versuchen keine Resorption der gebildeten MK stattfinden konnte. Die Ergebnisse zeigen, dass eine mikrobielle MK-Bildung im Intestinaltrakt von Hunden stattfindet und somit ein Beitrag zur Vitamin K-Versorgung durch diese Synthese geleistet werden dürfte. Fragen zur Resorption und biologischen Wirkung der verschiedenen MK bedürfen weiterer Untersuchungen, um die physiologische Bedeutung genauer schätzen zu können.

The term Vitamin K refers to at least two different types of quinones. Vitamin K1, phylloquinone (PK), is found in green leafy plants and several vegetable oils. Vitamin K2, menaquinone (MK), is produced by the intestinal microbiota of mammals and birds. MK differ in the length of their side chain and the common nomenclature is MK-n, “n” representing the number of isoprenoids. The objective of this study was to investigate the production of MK by the canine intestinal microbiota and the influence of substrate (protein and starch) in two different in-vitro-fermentation systems. Additionally, MK concentrations were determined in the chyme of different parts of the intestinal tract of dogs (duodenum, jejunum, ileum, caecum and colon). For the in-vitro-study, a semicontinuous long-term- and a 24h short-term incubation system were tested for their suitability. Based on the results of these tests, the 24h short-term incubation system was chosen as method. The trial was performed with three repetitions, each with ten airtight fermentation flasks. Faeces was obtained from dogs and diluted 1:100 in an anaerobic pre-reduced buffer with different amounts (0.1, 0.5 and 1.0 g) of maize starch (Ms), peptone (Pep) and a mixture of both (Ms/Pep; 50:50) including a control. The bottles were incubated with slow rotation for 24 hours at 37°C under subdued light. The pH was measured after incubation and samples were taken for the determination of volatile fatty acids, ammonium and lactate as fermentation parameters, as well as for the detection of MK by high-performance liquid chromatography (HPLC). The pattern of MK-4 to -10 was dominated by MK-10 followed by MK-9 and MK-4. Lowest concentrations were found for MK-7. An influence of the substrates could be observed regarding the total MK-concentration and the production of the different MK. The concentration of MK-7 to -10 increased after the addition of Ms and Ms/Pep and for MK-5 and -6 after Ms/Pep. Highest concentrations of MK-4 were found after the addition of Pep. The analysis of the chyme samples revealed similar MK-pattern. MK-10 was predominant in the caecal and colonal chyme followed by MK-6, -9 and -4. In the small intestine contents the formation of Vitamin K2 was dominated by MK-9. Highest total MK concentrations were measured in caecum and colon with an average of 635 ng/g and 1045 ng/g, respectively. The concentration in the small intestine decreased from duodenum to the ileum. The MK pattern of the short-term incubation and in the colon digesta was similar. In conclusion, the results pointed out that a production of MK takes place in the intestinal tract of dogs and might therefore contribute to cover the requirements of vitamin K. Further investigations about the mechanism of absorption and the biological activity are needed to obtain a better understanding about the physiological importance of MK.