In vitro und in vivo Untersuchungen zum Differenzierungspotenzial von humanen Stammzellen

Abstract

Ziel der Untersuchung war eine vergleichende Analyse des Differenzierungspotenzials von humanen adulten und embryonalen Stammzellen. Dabei wurden humane embryonale Stammzellen (hESZ) ungerichtet und spontan in vitro differenziert, während humane adulte Stammzellen (CD34+) erstmals in vitro mittels Ko-Kultur auf murinen AML12 Zellen gerichtet differenziert wurden. In vivo wurde die Kapazität zur Bildung von Teratomen von spontan vordifferenzierten hESZ in immundefizienten Mäusen umfassend geprüft. Auch wurden adulte CD34+ - Zellen direkt in die Leber von neugeborenen und adulten immundefizienten Mäusen appliziert. Die hESZ wurden auf unterschiedlichen Matrizen, wie murinen und humanen Zellen kultiviert und zeigten ein vergleichbares Expressionsprofil. Die Analyse der Markerexpression der undifferenzierten und spontan differenzierten Zellen erfolgte auf RNA-Ebene. Die spontane in vitro Differenzierung der hESZ zeigte zum frühen Zeitpunkt (14 Tage) einen leichten Anstieg der frühen endodermalen Marker und des hepatischen Differenzierungsmarkers Albumin. Zum späteren Zeitpunkt (82 Tage) wurde auf der Ebene der endodermalen Differenzierung eine höhere Expression der hepatischen Transkriptionsfaktoren und des endodermalen Markers verzeichnet, der ektodermale Marker war dagegen herunterreguliert. Die Pluripotenzmarker zeigten zu beiden Zeitpunkten eine gleich bleibend hohe Expression. Die mittels Ko-Kultur hepatisch induzierten CD34+ Zellen zeigten eine schwach ausgeprägte endodermale Differenzierung, nachgewiesen durch die Expression von Connexinen und Zytokeratinen. Wesentliche Änderungen der Zellmorphologie waren nicht nachweisbar. Die undifferenzierten hESZ exprimierten auf hohem Niveau Transkripte für Pluripotenz und die drei Keimblätter, zudem führten sie in vivo zur Teratombildung. Die spontane Differenzierung der hESZ in vitro über die Zeit (25, 60 und 89 Tage) führte zu einer niedrigeren Wachstumsrate und zu einem einheitlicheren histopathologischen Phänotyp in vivo. Weiterhin wurden in Teratomen von 25 und 60 Tagen vordifferenzierten Zellen frühe endodermale und hepatische Marker gefunden, jedoch keine in Teratomen von 89 Tage vordifferenzierten Zellen. Die intrahepatisch transplantierten CD34+ Zellen in neugeborenen Mäusen führte zu einem Anwachsen in unterschiedlichen Organen, wie Knochenmark, Milz und Thymus, sowie zu einer exklusiven Expression vom B-Zell Marker CD19. Nach Applikation in die Lebern von adulten Mäusen wurde dagegen kein Anwachsen in den Organen detektiert. Zusammenfassend wurde festgestellt, dass die humanen embryonalen, als auch adulten Stammzellen durch Anwendung unterschiedlicher in vitro und in vivo Methoden in Zellen mit endodermal-hepatischen, als auch hämatopoetischen Merkmalen, differenzieren.

In this study we analyzed the spontaneous differentiation of human embryonic stem cells (hESC) in vitro and in vivo and we investigate the influence of in vitro differentiation on in vivo teratoma formation in immunodeficient mice. Further, the hematopoetic stem cells (CD34+) were comparatively examined with respect to their normal and induced hepatic differentiation potential. In addition, we proved the engraftment of CD34+ cells in vivo after intrahepatical transplantation in immunodeficient mice. The SA002 human embryonic stem cells were cultured on irradiated mouse embryonic fibroblasts, on irradiated human foreskin fibroblasts, or feeder-free using matrigel. The CD34+ stem cells were cultured according to in-house established in vitro protocols. The marker expression of undifferentiated and differentiated stem cells was monitored by real time RT-PCR. Further microarray profiling, electron microscopy, FACS-analysis and dye transfer methods, as well as immunohistochemistry were used to determine the differentiation status of stem cell preparations. Undifferentiated SA002 stem cells were cultured under different conditions. These morphologically undifferentiated cells had a comparable marker expression profile, with high expression levels of pluripotency markers and low-to-moderate expression levels of germ layer markers. The undifferentiated CD34+ cells showed a high expression for CD34 transcript whereas endodermal markers were expressed on low level. The in vitro spontaneously differentiated SA002 stem cells demonstrated at early time points a slight upregulation of endodermal marker expression and of the liver marker albumin. At later time points, the expression of transcripts for hepatic and endodermal markers was upregulated, whereas expression of the ectodermal marker transcripts was downregulated. Expression of pluripotency markers remained high, and hematopoetic markers were not expressed. The induced hepatic CD34 cells showed a low endodermal differentiation potential with expression of transcripts for connexins and cytokeratins. Further, significant changes in cell morphology were not detectable. SA002 cells that showed spontaneous partial differentiation in vitro had a low teratoma formation capacity in vivo. Cells that were partially differentiated led to slower growing teratomas with more uniform histology. The intrahepatically transplanted CD34+ cells into newborn mice led to an engraftment in various organs like bone marrow, spleen and thymus as well as to an exclusive expression of B-cell markers. In summary, we determined that human embryonic as well as adult stem cells differentiate in cells with endodermal-hepatic properties using different methods. The results presented in this study can contribute to experimental research, especially the understanding of processes of organ differentiation, as well as the application of cell therapy in the context of regeneration.