Einfluss von Acetylcystein auf Transient Receptor Potential Canonical Typ 6 (TRPC6)- Kanäle auf humanen Monozyten

Abstract

Transient Rezeptor Potential Canonical Kanäle Subtyp 6 (TRPC6 Kanäle) sind sog. nicht- selektive Ionenkanäle, die in einer Reihe von Geweben und peripheren Blutzellen nachgewiesen werden konnten. Nach Aktivierung der TRPC6 Kanäle kommt es unter Anderem zu einem transmembranösen Calcium- Einstrom. In der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkungen von oxidativen Stress und der antioxidativ wirksamen Substanz Acetylcystein (ACC) auf die Expression und die Funktion von TRPC6- Kanälen in humanen Monozyten untersucht. Die Expression von TRPC6 Kanälen, phosphoryliertem Extracellular signal- Regulated Kinase (pERK, aktivierte Form) und ERK (nicht- aktivierte Form) in den Monozyten wurde mittels quantitativen In- Cell Western Assay bestimmt. Der Calcium- Einstrom in die Zellen wurde Fluoreszenz- spektrophotometrisch mit dem Farbstoff Fura 2 bestimmt. Reaktive Sauerstoffradikale wurden mit dem Farbstoff 2´, 7´Dichlorodi-hydrofluorescindiacetat (H2DCF- DA) gemessen. Die Monozyten- Chemotaxis wurde in einer Boyden Chamber (Migrations Assay) untersucht. Die Inkubation von Monozyten mit ACC führte zu einem signifikanten Anstieg der TRPC6 Protein Expression von 0,0431 ± 0,0015 auf 0,0549 ± 0,0024 (n = 12, Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes SEM; p < 0.001). Der Effekt von ACC war zeit- und dosisabhängig. Die Inkubation der Monozyten mit Homocystein führte ebenfalls zu einem Anstieg der TRPC6 Expression auf 0,0688 ± 0,0017 (p < 0,001). Glutathion hatte keinen Effekt auf die TRPC6 Expression (0,0436 ± 0,0018; p = n. s.). ACC führte zu einem signifikanten Anstieg von aktiviertem pERK (0,1251 ± 0,0149 vs. 0,2831 ± 0,0209; n = 3; p < 0,001), nicht aber von nicht- aktiviertem ERK. Dieser Anstieg von pERK konnte durch die Vorgabe von TRPC6 Kanal- Blockern wie 2- Aminoethoxydiphenyl- boran (2APB) oder Gadolinium verhindert werden. ACC führte zu einer signifikanten Verminderung der Phorbolmyristate acetate (PMA)- induzierten Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen von 39,64 ± 0,26 auf 16,89 ±0,005 (n = 3, p < 0,001). Weiterhin führte ACC zu einer signifikanten Verminderung der spontanen Monozyten- Migration. Im Gegensatz zeigte Homocystein (HC) keinen signifikanten Effekt auf die Migration. Die Untersuchungen zeigen, dass das antioxidativ wirkende Acetylcystein durch die Verminderung von reaktiven Sauerstoffradikalen die Expression von TRPC6 Kanälen und die Migration von Monozyten beeinflussen.

Transient receptor potential canonical channels subtype 6 (TRPC6 channels) are non- selective cation channels which have been found in several different tissues and peripheral blood cells. Activation of TRPC6 channels leads to a transmembranous calcium influx. In the present study effects of oxidative stress and the antioxidant acetylcysteine (ACC) on TRPC6 channel expression and function in human monocytes have been investigated. TRPC6 protein expression and expression of phosphorylated extrecellular signal- regulated kinase (pERK) and extracellular signal- regulated kinase (ERK) were investigated using quantitative in- cell western assay. Calcium influx was detected using fluorescence spectrophotometry with Fura-2. Reactive oxygen species were assessed by DCFDA fluorescence. Chemotaxis has been determined by the Boyden chamber assay (migration assay). Monocytes incubated with ACC showed a significant increase of TRPC6 expression from 0,0431 ± 0,0015 to 0,0549 ± 0,0024 (n = 12, mean ± standard error of the mean SEM; p < 0.001). This effect was time- and dose- dependent. Incubation with homocysteine showed as well a significant increase of TRPC6 to 0,0688 ± 0,0017 (p < 0,001) while glutathione (GSH) had no effect on TRPC6 expression (0,0436 ± 0,0018; p = n. s.). Additionally, there was a significant increase of pERK after ACC incubation (0,1251 ± 0,0149 vs. 0,2831 ± 0,0209; n = 3; p < 0,001) which could be blocked by TRPC6 channel blocker 2APB or Gadolinium. ACC significantly decreases reactive oxygen species induced by phorbol-12- myristate- 13- acetate from 39,64 ± 0,26 to 16,89 ±0,005 (n = 3, p < 0,001). Furthermore incubation with ACC results in a significant reduction of spontaneous migration of monocytes while HC had no effect on migration. The conclusion of this study is that the antioxidant ACC affects TRPC6 expression and monocyte migration by reducing reactive oxygen species.