Viral and non-viral generation and characterization of induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid cells

Abstract

The ability to induce pluripotency in somatic cells offers unprecedented opportunities in basic and applied research. The implementation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) into clinical settings, however, is hampered by genetic modifications associated with retro- or lentivirus-mediated reprogramming. The quest for efficient alternative reprogramming approaches has been closely connected with the identification of cell sources, which readily acquire the pluripotent stem cell (PSC) state. Human amniotic fluid cells (AFCs) represent routinely available cells with stem cell-like features, which could presumably facilitate efficient reprogramming even by non- integrating techniques. The goal of this project was to generate and comparatively characterize iPSCs derived from human AFCs by viral and non- viral techniques with respect to human embryonic stem cells (ESCs), the golden standard of PSCs, and iPSCs generated from cells of other tissues of origin. Retrovirus-mediated overexpression of the reprogramming factors in primary human AFCs resulted in fast and efficient generation of iPSCs (AFiPSCs), which resembled human ESCs with regards to morphology, proliferation and marker expression. Their ability to differentiate into derivatives of the three embryonic germ layers was demonstrated in vitro and in vivo and upon BMP2 and BMP4-treatment expression of trophoblast markers, including CDX2, KRT7 and HAND1, was confirmed. Detailed microarray-based transcriptome analysis of ESCs, AFiPSCs, fibroblast-derived iPSCs (FiPSCs) and the respective parental cell lines revealed the activation of a transcriptional regulatory network common to all PSCs but also highlighted, for example, residual gene expression signatures in iPSCs from different tissues of origin. These findings were summarized in a concept coined the LARGE Principle of Cellular Reprogramming. Genetic manipulation of AFiPSCs was not accomplished. Attempts to reprogram human AFCs by non-viral, non-integrating methods included nucleofection of episomal plasmids and lipofection of mRNAs encoding the reprogramming factors. Despite multiple trials fully reprogrammed iPSCs could not be established. In depth analysis of the cellular response to the transfected mRNAs uncovered an extensive induction of interferon-regulated immune-related genes to be the key roadblock in mRNA-mediated reprogramming. Subsequent efforts to identify chemicals which could suppress this innate immune reaction did not yield potent candidates. The data presented herein, however, provide the basis for further investigations into this effect. In summary, this work highlights the value of human AFCs for the derivation of iPSCs and emphasizes the obstacles that need to be overcome before AFiPSCs can potentially be employed into clinical settings.

Die Entwicklung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPSCs) aus somatischen Zellen eröffnet ungeahnte Möglichkeiten für Forschung und Medizin. Der Verwendung von iPSCs zu therapeutischen Zwecken stehen derzeit jedoch die mit der viralen Reprogrammierung einhergehenden Modifikationen des Genoms im Wege. Das Streben nach alternativen, nicht-mutagenen Reprogrammierungsmethoden ist aufgrund deren geringerer Effizienz eng an die Identifizierung von Zelltypen gekoppelt, die sich einfacher in das Entwicklungsstadium embryonaler Stammzellen (embryonic stem cells, ESCs) zurückversetzen lassen. Humane Fruchtwasserzellen (amniotic fluid cells, AFCs) werden routinemäßig isoliert und weisen Stammzell-ähnliche Eigenschaften auf. Dadurch sind AFCs vermutlich auch durch ineffizientere nicht-mutagene Methoden zu reprogrammieren. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe viraler und nicht-viraler Techniken aus AFCs iPSCs zu generieren und diese vergleichend zu charakterisieren. Dabei sollten auch humane ESCs, als Standard für pluripotente Stammzellen, sowie iPSCs aus Zellen anderer Gewebe (Fibroblasten-iPSCs, FiPSCs) einbezogen werden. Die retrovirale Reprogrammierung führte schnell und effizient zur Umwandlung humaner AFCs in iPSCs (AFiPSCs). Diese iPSCs glichen humanen ESCs im Hinblick auf die Morphologie, Proliferation und die Expression von Stammzellmarkern. Ihre Fähigkeit, Zelltypen aller drei embryonalen Keimblätter zu bilden, konnte sowohl in vitro als auch in vivo bestätigt werden. Als Ergebnis der Behandlung der AFiPSCs mit BMP2 und BMP4 wurde darüber hinaus ihr Potential, in Zelllinien des Trophoblasten zu differenzieren, demonstriert. Eine detaillierte Microaray-basierte Analyse der Transkriptome von ESCs, AFiPCs, FiPSCs sowie der jeweiligen parentalen Zellen bestätigte die Aktivität eines transkriptionell regulatorischen Netzwerks in allen pluripotenten Stammzellen. Gleichzeitig wurden beispielsweise aber auch charakteristische Genexpressionsmuster in den verschiedenen parentalen Zelltypen identifiziert, die nach der Reprogrammierung erhalten blieben. Diese und ähnliche Befunde wurden im sogenannten "LARGE Principle of Cellular Reprogramming" zusammengefasst. Eine genetische Manipulation der AFiPSCs zur Gen-Funktions- Analyse konnte nicht realisiert werden. Versuche, humane AFCs durch nicht- virale, nicht-mutagene Methoden, wie der Nukleofektion von episomalen Plasmiden oder der Transfektion von Reprogrammierungsfaktoren-kodierenden mRNAs, zu reprogrammieren, scheiterten. Die ausführliche Untersuchung der Ursachen dafür ergab, dass die schwerwiegende Aktivierung einer Interferon- regulierten Immunantwort die Reprogrammierung maßgeblich hemmte. Anschließende Versuche, diese Immunabwehr durch geeignete immunmodulatorische Substanzen zu unterbinden, blieben jedoch ohne Erfolg. Die im Laufe dieser Arbeit ermittelten Daten stellen dennoch eine wichtige Grundlage für weiterführende Tests dar. Zusammenfassend konnte anhand dieser Arbeit der Stellenwert humaner AFCs für die Generierung von iPSCs hervorgehoben werden. Dabei wurden jedoch auch bestehende Hindernisse aufgezeigt, welche einer potentiellen Anwendung von AFiPSCs zu therapeutischen Zwecken noch im Wege stehen.