The application of Layer-by-layer technology in nucleic acid sensing systems

Abstract

Polyelectrolyte multilayers assembled by the Layer-by-Layer (LbL) technique exhibit unique properties such as nano-thickness/roughness, semipermeability, tunable physical properties and the versatility of surface modification on a wide range of substrates. The aim of this work was to exploit the outstanding properties of the LbL films for construction of a novel nucleic acid detection system based on colloidal particles. LbL films were deposited on particle surface where oligodeoxyribonucleotides (ODNs) were covalently immobilised as probe molecules for selective binding of target DNA (hybridisation assay). The detection of the hybridisation was realized by Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) between a fluorescent donor dye on the particle and an acceptor dye on the target DNA sequence. This method allowed the determination of hybridisation events without washing non-bound DNA away as it is normally necessary for other DNA hybridisation assays. Further advantages of the LbL- ODN system over conventional particle based DNA sensing systems as low non- specific binding and extraordinary high target binding capacity were determined. This was thanks to the specific surface properties of the LbL films such as roughness, flexibility and exact dye molecule positioning in the nanometer scale. An undesired decrease of fluorescence quantum yield as well as changes in the absorption and emission spectra of certain FRET fluorophores were observed after the dye molecules were coupled onto the polyelectrolytes due to formation of non-fluorescent H-aggregates. A mechanism of the dye H-aggregate formation was proposed and a new synthesis route of dye labelled polyelectrolytes was developed. As a result, the dye H-aggregates could be minimised, allowing a better applicability of dye labelled polyelectrolyte in fluorescence sensing structures. Furthermore, when the stability of the LbL- ODN system was tested against several external parameters such as temperature, ionic strength and the presence of surfactants, it was discovered that some LbL films were strongly responsive to cationic surfactants. The structural changes of the LbL film upon interaction with several cationic surfactants were investigated and a mechanism of the responsive behaviour was derived. By crosslinking the polyelectrolyte layers, a strategy was developed to stabilise the film. On the other hand, it was shown that cationic surfactants can be used as an efficient trigger for controlled release of the LbL film encapsulated substances. The aforementioned findings allowed successful exploitation of the LbL technology for the preparation of a particle based nucleic acid detection system as a homogeneous diagnostic assay.

Polyelektrolytmultischichten hergestellt durch die Layer-by-Layer (LbL) Technologie besitzen einzigartige Eigenschaften wie nanometerdicke Schichten, Rauhigkeit, Semipermea¬bilität, einstellbare physikalische Eigenschaften sowie eine große Bandbreite für Ober¬flächenmodifi¬kationen auf fast allen Substraten. Ziel der Arbeit war es, die besonderen Eigenschaften der LbL-Filme für die Entwicklung eines neuen, auf kolloidalen Partikeln basierenden Nukleinsäure-Nachweissystems zu nutzen. Dazu wurden LbL-Schichten auf kolloidalen Partikeloberfläche abgeschieden und darauf Oligodesoxyribonukleotide (ODN) immobilisiert, welche als Testmoleküle für die selektive Bindung einer Target-DNA fungieren (Hybridisierungstest). Der Nachweis einer erfolgrei¬chen Hybridisierung erfolgte über Fluoreszenz Resonanz Energy Transfer (FRET) zwischen einem auf dem Partikel gebundenen fluoreszenten Donorfarbstoff und einem an der nachzu¬weisenden DNA gebundenen Akzeptorfarbstoff. Diese Methode erlaubt die Bestimmung von Hybridisierungsereignissen ohne vorheriges Wegwaschen von DNA anderer Sequenz, wie es in bisherigen DNA Tests notwendig ist. Weitere Vorteile des LbL-ODN- Systems über konventionelle, partikelbasierte DNA-Nachweissysteme sind geringe unspezifische Bindungen und eine außergewöhnlich hohe Bindungskapazität für die nachzuweisende DNA. Maßgeblich für die Verbesserungen sind die spezifischen Oberflächeneigenschaften der LbL-Filme wie die Rauhigkeit, Flexibilität sowie die im Nanometerbereich genaue Positionierung der Farbstoffmoleküle. Unerwünschte Effekte wie die Abnahme der Fluoreszenz- Quantenausbeute oder Änderungen in den Absorptions- und Emissionsspektren verschiedener FRET Flurophore wurden nach Bindung der Farbstoffmoleküle an die Polyelektrolyte gefunden. Als Ursache wurde die Bil¬dung von nicht- fluoreszierenden H-Aggregaten der Farbstoffmoleküle ermittelt wofür ein Mechanismus aufgestellt wurde. Ein neuer Syntheseweg für Farbstoff-gelabelte Polyelektro¬lyte wurde entwickelt, der die Bildung von H-Aggregaten minimiert. Damit werden fluores¬zenzgelabelte Polyelektrolyte als analytische Sonden besser anwendbar und das LbL-ODN-Systems konnte weiter verbessert werden. Stabilitätstests des LbL-ODN-Systems gegenüber Parametern wie Temperatur, Ionenstärke und amphiphilen Stoffen zeigten, dass LbL-Schichten auf die Anwesenheit kationischer Detergentien stark reagieren. Die ausgelösten strukturellen Änderungen im LbL-Film wurden untersucht und aus den Ergebnissen ein Mechanismus der Wechselwirkungen abgeleitet. Eine ausreichende Stabilisierung der LbL-Filme gegenüber Detergentien wurde durch Quervernet¬zung der Filme erreicht. Es wurde gezeigt, dass kationische Detergenzien auch als effiziente Trigger für eine kontrollierte Freisetzung von LbL verkapselten Substanzen ausgenutzt werden können. Die erhaltenen Forschungsergebnisse erlauben eine erfolgreiche Anwendung der LbL-Technologie für die Herstellung eines partikelbasierten Nukleinsäure-Nachweissystems für einfach durchzuführende Diagnose-Tests.