Festkörper-NMR-Spektroskopie am ABC-Transporter ArtMP-J aus G. stearothermophilus

Abstract

Die ATP-binding cassette-Transporter (ABC-Transporter) nutzen die Energie aus der ATP-Hydrolyse für die unidirektionale Translokation verschiedenster Substrate über biologische Membranen. Auf Grund ihrer bedeutenden Rolle in physiologischen und pathophysiologischen zellulären Prozessen ist die Aufklärung ihres komplexen molekularen Mechanismus der Substrattranslokation von großem medizinischem Interesse. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Konzepte zur strukturellen Charakterisierung des ABC- Transportsystems ArtMP-J aus G. stearothermophilus mittels Festkörper-NMR- Spektroskopie beschrieben, die als Grundlage für weiterführende NMR-Studien zu Struktur und Dynamik des Transporters dienen sollen. Der große Vorteil dieser Technik beruht darauf, dass Membranproteine in einer nativen Lipidumgebung strukturell und dynamisch untersucht werden können. ArtMP-J ist für den Import polarer Aminosäuren über die Zytoplasmamembran verantwortlich. Das langfristige Ziel ist die strukturelle und dynamische Charakterisierung des gesamten Transportkomplexes, eingebettet in seine native Lipidumgebung. Für eine bessere Differenzierung zwischen den NMR-Signalen von ArtP und ArtM im Proteinkomplex wurde ArtMP so präpariert, dass der Komplex aus einer markierten und einer unmarkierten Untereinheit zusammengesetzt ist. Hierzu wurden Methoden zur Herstellung und Assemblierung der einzelnen Untereinheiten zu einem intakten Transportkomplex etabliert. So wurde die Präparation einer stabilen NMR-Probe, die aus markiertem ArtP und unmarkiertem ArtM besteht und in Lipide aus G. stearothermophilus eingebettet ist, ermöglicht. Die Nukleotidbindedomäne ArtP wurde isoliert (3D-Kristalle) sowie im Transmembrankomplex ArtM(P) (2D-Kristalle) in verschiedenen nukleotid- gebundenen Zuständen mittels 13C-13C- Korrelationsexperimenten untersucht, wobei die Proteine selektiv mit den Aminosäuren Threonin, Tyrosin und Prolin (TYP) 13C, 15N-markiert waren. Parallel dazu wurden 1H-detektierte Festkörper- NMR-Techniken zur strukturellen Untersuchung von ArtP und ArtMP angewendet. Hierfür wurde ein Präparationsprotokoll zur Herstellung von [15N, 13C, 2H/1H]-markiertem ArtPDCN etabliert. Die hoch aufgelösten Festkörper-INEPT- Spektren von ArtM(PDCN) zeigten gute Übereinstimmung mit dem 1H-15N-Lösungs- NMR-Spektrum von ArtPDCN, so dass die Zuordnung einzelner Signale auf die Festkörper-NMR-Spektren übertragen werden konnte. Es konnten mittels 13C-13C- als auch 1H-15N-Korrelationsexperimenten gezeigt werden, dass sich die Konformation von ArtP in 3D-Kristallen von der im Komplex ArtM(P) in nativen Lipiden unterscheidet. Davon zeigten die Aminosäurereste Gly 197/212 und Leu 14 unterschiedliche chemische Verschiebungen in den Spektren von ArtM(PDCN) ohne bzw. mit Nukleotid. Zukünftig sollten Untersuchungen an den einzelnen Untereinheiten des intakten Transportkomplexes in nativen Lipiden durchgeführt werden, um Struktur und Funktion von ArtMP nahe an seinem nativen Zustand zu charakterisieren.

ATP-binding cassette transporters are found in all three domains of life. They energize the unidirectional substrate transport across biological membranes by ATP hydrolysis and are involved in many physiological and pathophysiological processes in cells. Therefore it is of high medical interest to elucidate their molecular mechanism of substrate translocation. This thesis describes different concepts for structural characterization of the ABC transporter ArtMP-J from G. stearothermophilus by solid-state NMR spectroscopy. These approaches exhibit the basis for further NMR studies to shed light on structural and dynamic properties of the ABC transporter. Solid-state NMR spectroscopy enables the structural investigation of membrane proteins in a native-like environment. ArtMP-J is responsible for the transport of amino acids across the cytoplasmic membrane. The long-term goal is the structural and dynamic characterization of the active transport complex ArtMP embedded in its native lipid environment by solid-state NMR spectroscopy. For this reason ArtMP should be composed of a labeled and an unlabeled subunit in order to reduce the number of signals and to differentiate between signals from ArtM and ArtP. Therefore preparation protocols for the separate production of ArtM and the assembly of the isolated subunits to an active transport complex were established. This approach enabled the preparation of stable NMR samples of ArtMP composed of isotopically labeled ArtP and unlabeled ArtM reconstituted in lipids from G. stearothermophilus. The nucleotide-binding domain ArtP was investigated as an isolated subunit (3D crystals) and in the transmembrane complex ArtM(P) (2D-crystals) with different nucleotides by 13C-13C- correlation experiments. ArtP was labeled selectively with the amino acids [13C, 15N]-threonine, -tyrosine and -proline (TYP). In a further approach it was tested whether proton detected solid-state NMR techniques are suitable for structural studies of ArtM(P). For this purpose it was necessary to label ArtMP and ArtP with the isotopes 15N, 13C, 2H. The high resolution spectrum of ArtM(PDCN) superimposed well with the 1H-15N-solution-state spectrum of ArtPDCN. So it was possible to transfer the assignment of some signals to the solid-state spectra. It turned out that glycine 197/212 and leucine 14 were sensitive to conformational changes by nucleotide binding in ArtP. 13C-13C – and 1H-15N-correlation experiments have shown that the conformation of isolated ArtP in 3D crystals differs from the complex ArtM(P) in native lipids. For this reason structural and functional investigations of the subunits ArtM and ArtP should be carried out in an active complex, which is reconstituted in native lipids.