Genomic Deletion of Enhancers Uncovers Principles of Combinatorial Regulation and Cell Type-Specific Gene Expression

Abstract

Transcription factors (TFs) are fundamental to the regulation of genes by binding to genomic enhancer elements and orchestrating the expression of their target genes. However, it is largely unclear which TF binding event(s) contribute to the regulation of a specific gene, how cell type-specific plasticity in gene expression is achieved and what minimal circuitry is required to regulate a gene depending on the activity of a specific TF. Here, I used the glucocorticoid receptor (GR), a hormone-activated TF, as a model system to study the molecular mechanisms that determine the functional role of enhancers. By genomically deleting, either alone or in combination, multiple GR binding sites (GBSs) located within the GILZ enhancer, I systematically investigated the interplay of multiple TF binding sites. This mutational analysis demonstrated that multiple GBSs are bound independently but can act cooperatively on gene expression as a single functional unit, which is only active when all of its GBSs are intact. Furthermore, the deletion of GBSs shared between two different cell types demonstrates how cell type-specific differences in the three-dimensional (3D) genome organization and enhancer blocking can rewire enhancer-promoter contacts. This rewiring enables a GBS bound in two different cell types to direct the expression of distinct transcript variants, thereby contributing to the cell type-specific consequences of glucocorticoid signaling. Finally, I investigated the effect of DNA motif sequence on GR activity, by exchanging the sequence of a single GBS of the GILZ enhancer into different GBS motif variants. Whereas in reporter assays this exchange resulted in quantitative changes in gene expression, no effect was observed upon exchange in the endogenous context. Hence, the genomic context can influence the regulatory potency of individual GBS variants, for example by integrating regulatory information from multiple GBSs. To investigate the role GBS variants in an isolated endogenous context, I integrated a GBS at the promoter region of an endogenously silenced gene, thereby activating its expression in a GR-dependent manner. This demonstrates that a single GBS can be sufficient to induce GR-mediated regulation of an associated gene and further provides a model system to investigate the effect of GBS sequence variants in isolation. Together, genomic editing of GBSs in their endogenous genomic context enables insights into the operating priniciples of combinatorial gene regulation by multiple TF binding sites, but also demonstrates that a single promoter-proximal GBS is sufficient to induce GR-dependent gene expression. Furthermore, a GBS equally bound in two different cell types can contribute to the establishment of cell type-specific gene expression patterns by differences in 3D genome organization and enhancer blocking.

Die Bindung von Transkriptionsfaktoren (TF) an genomische Enhancer-Elemente ist elementar für die Regulation von Genen. Bis heute ist es jedoch weitgehend unklar, welche Bindungsereignisse zur Regulation eines spezifischen Zielgenes beitragen, wie unterschiedliche Genexpressionsmuster zelltypspezifisch reguliert und welche minimalen Regulationsanordnungen benötigt werden, um ein Gen TF-abhängig zu regulieren. In meiner Doktorabeit verwende ich als Modelsystem den Glukokortikoidrezeptor (GR), einen hormon-aktivierbaren TF, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die funktionelle Rolle von Enhancer-Elementen beeinflussen. Durch die genomische Zerstörung von einzelnen und mehreren GR-Bindestellen (GBS) des GILZ Enhancers, habe ich das regulatorische Zusammenspiel von mehreren TF-Bindestellen systematisch untersucht. Diese Mutationsanalyse zeigte, dass mehrere GBS zwar voneinander unabhängig durch GR gebunden werden, aber dennoch kooperativ als funktionelle Einheit die Genexpression beeinflussen, so lange alle beinhalteten GBS intakt sind. Durch die genomische Zerstörung einer GBS, die in zwei verschiedenen Zelltypen von GR gebunden wird, konnte ich zudem zeigen, dass zelltypspezifische Unterschiede in der dreidimensionalen (3D) Genomorganisation und Enhancer-Blocking Enhancer-Promoter Kontakte neu verbinden kann. Die Verbindung unterschiedlicher Enhancer-Promoter Kontakte ermöglicht die Expression verschiedener Transkriptvarianten eines Genes und kann dadurch zu den zelltypspezifischen Effekten von Glukokortikoiden beitragen. Zudem habe ich den Effekt von DNA Motifsequenzen auf die Aktivität von GR untersucht, indem ich die Sequenz einer GBS des GILZ Enhancers in verschiedene GBS-Motifsequenzen umgewandelt habe. Während in Reporter Assays der Austausch von GBS-Motifvarianten in quantitativen Unterschieden in der Genexpression resultierte, zeigte sich im genomischen Kontext kein Effekt auf die Regulation von GILZ. Demzufolge, kann der genomische Kontext die regulatorische Wirkung von GBS-Motifvarianten beeinflussen, z.B. durch die Integration von regulatorischer Information von mehreren GBS. Um GBS- Motifvarianten in einem isolierten, endogenen Umfeld zu untersuchen, habe ich eine einzelne GBS an der Promoter-Region eines endogen nicht exprimierten Genes platziert. Diese Integration zeigt, dass die Präsenz einer einzelnen GBS ausreichen kann, um ein Gen GR-abhängig zu regulieren und stellt zudem ein Modelsystem dar, um die Rolle von GBS-Motifvarianten in Isolation zu testen. Zusammenfassend kann die genomische Editierung Einblicke in die Funktionsweise der kombinatorischen Regulation durch mehrere TF-Bindestellen ermöglichen und zeigt zudem, dass eine einzige Promoter-proximale GBS ausreichen kann, um ein Gen GR-abhängig zu regulieren. Zusätzlich zeigt diese Arbeit, dass eine GBS, die in zwei verschiedenen Zelltypen gleichermaßen gebunden wird, durch Unterschiede in der 3D Genomorganisation und Enhancer-Blocking zur zelltypspezifischen Genexpression beitragen kann.