Development of highly sensitive and selective applications for glycoproteomics and clinical glycomics

Abstract

Glycan structure elucidation, either on released oligosaccharides or still attached to proteins/peptides, remains a challenging task mostly due to the complexity embedded in these key molecules. Uncovering the functional relevance of glycosylation in biological systems can be used for disease diagnosis and treatment. The aim of this work was to develop highly sensitive and selective clinical glycomics and glycoproteomics tools. A method for the extraction of N-and O-glycans from histopathological tissue sections (formalin-fixed & paraffin-embedded and/or Hematoxylin & Eosin stained) was developed. The use of laser capture microdissection provided the opportunity to gain spatial insights into the glyco-epitope distribution in hepatocellular carcinoma and surrounding non-tumor tissue from as low as a few thousand cells. For the first time detailed linkage information on structural isomers (e.g. 2,3 vs. 2,6 linked sialic acids) and important glycan epitopes (e.g. such as Lewis X) could be determined from minimal amounts of clinical tissue specimens. This developed approach represents an enormous step forward in the quest to identify disease specific glycan signatures. For the glycoproteomic investigations defined glycopeptide standards were synthesized. These were employed to systematically investigate glycopeptide fragmentation in quadrupole-time-of-flight mass spectrometer to improve the information content of tandem MS data for software-assisted glycopeptide analysis. Optimal analysis conditions were used in a glycoproteomic analysis of the entire set of human immunoglobulins. The glycopeptide standards were also key compounds to explore the potential of ion mobility–mass spectrometry (IM-MS) for providing glycan structure information from isobaric glycopeptides. IM-MS was able to differentiate N-glycopeptide positions isomers. Even more importantly, IM-MS could be used to differentiate α2-6 from α2-3 sialic acid (NeuAc) linkage isomers. This was achieved by IM-MS separation of oxonium ions (NeuAc- Gal-GlcNAc; 657 m/z) generated by collision induced dissociation of isolated precursor ions but not on the level of intact glycopeptides. Using this technology for the first time NeuAc linkages can be studied in a site-specific manner within a single experiment. In future this capacity will provide novel insights on the role of sialic acid in health and disease.

Die detaillierte Charakterisierung von Glykanen, in gelöster Form oder in Verbindung mit Proteinen/Peptiden, stellt aufgrund der ihnen innewohnenden umfassenden Komplexität eine enorme Herausforderung dar. Die Aufklärung ihrer biologischen Funktionen ist für den Kampf gegen Krankheiten von entscheidender Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von hochsensitiven und selektiven Methoden zur Anwendung in der klinischen Glykomik und Glykoproteomik. Es wurde ein Protokoll für die Extraktion von N- und O-glykanen aus klinischen Gewebeproben (Formalin-fixiert & Paraffin- eingebettet und/oder Hematoxilin & Eosin gefärbt) entwickelt. Mit Hilfe von Laser-Mikrodissektionen war es zudem möglich räumliche Glykanprofile von Gewebestücken von nur wenigen tausend Zellen (Leberzellkarzinom) und angrenzenden Gebieten zu erstellen. Zum ersten Mal konnten detaillierte Informationen über Glykan-Isomere (z.B. 2,3 und 2,6 verknüpfte Sialinsäuren) und wichtige Epitope (z.B. Lewis X) von kleinsten Mengen klinischen Materials gewonnen werden. Daher stellt diese Methode ein wertvolles Werkzeug bei der Suche nach geeigneten Glykan Biomarkern dar. Für die glykoproteomischen Arbeiten wurden definierte Glykopeptidstandards hergestellt. Diese wurden dann benutzt um systematisch deren Fragmentierung in Quadrupol- Flugzeitmassenspektrometern zu untersuchen und den Informationsgehalt der entstandenen Fragment-Ion-Spektren für eine bessere computer-assistierte Datenanalyse zu erhöhen. Die optimalen Parameter wurden dann u.a. mittels diverser humaner Immunglobuline validiert. Die synthetischen Glykopeptide wurden weiterhin verwendet, um das Potential der Ionen-Mobilitäts- Massenspektrometrie zur Glykopeptid Charakterisierung zu untersuchen. Es hat sich gezeigt, dass die untersuchten N-glykopeptid-Positionsisomere mittels der Methode unterscheidbar waren. Weiterhin konnten isobare Glykopeptide, welche nur in ihrer terminalen Sialinsäureverknüpfung variierten (α2-6 bzw. α2-3), auf Fragment-Ebene unterschieden werden. Dies geschah an Hand von Oxonium- Ionen (NeuAc-Gal-GlcNAc; m/z 657), welche zuvor durch kollisionsinduzierte Dissoziation der Vorläuferionen generiert wurden. Zukünftig ermöglicht die Methode die Bestimmung von Sialinsäureverknüpfungen auf Glykopeptiden in einem Experiment, was die Untersuchung von Sialiansäuren in einem bestimmten biologischen Kontext sehr vereinfachen wird.