Untersuchungen zur transkriptionellen Regulation des Erythropoietin-Rezeptor- Gens in Kardiomyozyten

Abstract

Erythropoietin (Epo), der primäre Regulator für die Bildung roter Blutkörperchen, wird primär in der fetalen Leber und in den ausgereiften Nieren exprimiert. Seine Wirkung vermittelt Epo durch Bindung an seinen spezifischen Rezeptor (EpoR), welcher nicht nur in hämatopoietischen, sondern auch in nicht-hämatopoietischen Geweben, unter anderem dem Herzen, exprimiert wird. Zahlreiche experimentelle in vitro und in vivo Studien belegen, dass der EpoR auf Kardiomyozyten gewebeschützende Effekte von rekombinantem Epo (rEpo) während ischämischer oder medikamentöser Schädigung des Herzens vermittelt. Die transkriptionellen Mechanismen der EpoR Regulation im Herzen sind bisher nicht bekannt, aufgrund der kardioprotektiven und antiapoptotischen Effekte von rEpo jedoch von großen klinischem Interesse. Ziel der Arbeit war es deshalb, die molekularen Mechanismen der transkriptionellen Aktivierung des kardialen EpoR Promotors zu identifizieren. Mittels Reportergenanalysen in HL-1 Kardiomyozyten konnte eine 774 bp lange regulatorische Domäne im EpoR Promotor identifiziert werden, in welcher ins-besondere die GC- und GATA-Box zur EpoR Promotoraktivität beitragen. EMSA und ChIP-Analysen belegen die Bindung von Gata4 und Sp1 an den EpoR Promotor. Die Funktionalität beider Transkriptionsfaktoren wurde durch Überexpressionen und knockdown Experimente bewiesen. Ferner wurde in transgenen Mäusen mit induzierbarer shRNA gegen Gata4 die Funktion von Gata4 auf den EpoR Promotor in vivo bestätigt. Auch im Modell der Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie korrelierte die EpoR Expression mit der Gata4 Depletion und einer anschließenden Erholung der Gata4 Level. Unter Hypoxie konnte in HL-1 Kardiomyozyten ein signifikanter Anstieg der endogenen EpoR mRNA beobachtet werden. Mittels Reportergenanalysen wurde im ersten Intron des EpoR Gens ein Hypoxie-induzierbares DNA-Element identifiziert. Mutationsanalysen zeigten, dass vor allem eine konservierte GATA-Box und ein hypoxia response element (HRE) für die hypoxische Induktion essentiell sind und neben Gata-Transkriptionsfaktoren auch der HIF-Kompex (hypoxia inducible factor) an der transkriptionellen Regulation unter Hypoxie beteiligt sein könnte. Die Daten zeigen, dass Gata4 und Sp1 den kardialen EpoR Promotor aktivieren. Dies stellt einen neuen gewebespezifischen Mechanismus dar, der sich sowohl von häma¬topoietischen als auch von neuronalen Zellen unterscheidet. Zusätzlich liefert diese Studie Hinweise dafür, dass Gata4 für den Erhalt normaler EpoR Level und damit für den erfolgreichen Einsatz von rEpo zur Kardioprotektion essentiell ist.

Erythropoietin (Epo), the primary regulator for erythropoiesis, is mainly produced by the fetal liver and the adult kidney. Effects of Epo are mediated by binding to its specific receptor (EpoR), which is not only expressed in hematopoietic cells, but also in non-hematopoietic tissue such as the heart. Experimental in vitro and in vivo studies show that the EpoR on cardiomyocytes mediates the tissue-protective effects of recombinant Epo (rEpo) in ischemic heart injuries or doxorubicin-induced cardiomyopathy. However, the transcriptional mechanisms of the EpoR gene regulation in cardio¬myocytes are unknown yet, but due to the cardioprotective and antiapoptotic effects of rEpo of great clinical interest. The aim of the study was to identify tissue- specific mechanisms and transcription factors regulating the EpoR promoter in cardiomyocytes. Using reporter gene assays, we identified in murine HL-1 cardiomyocytes a 774 bp regulatory domain EpoR promoter, in which a GC- and a GATA-box mediate the promoter activity. EMSA and chroma¬tin- immunopreci¬pitation experiments indicated specific binding of Gata4 and Sp1 to the EpoR promoter. Functional relevance of Gata4 and Sp1 for the transcriptional regulation of EpoR showed ectopic expression and knockdown analysis of Gata4 and Sp1. Transgenic mice with an inducible shRNA against Gata4 confirmed the suppression of EpoR expression when Gata4 levels were reduced. In the model of doxorubicin-induced cardiomyopathy EpoR level correlated with Gata4 depletion and following restoration. Under hypoxia a significant induction of EpoR mRNA expression in HL-1 cardiomyocytes was observed. Reporter gene assays identified a hypoxia-inducible element in the first intron of the EpoR. Mutational analysis revealed a GATA-box and hypoxia respone element (HRE) as essential DNA-motifs indicating participation of Gata transcription factors and the HIF-complex (hypoxia inducible factor) on the hypoxic induction of the EpoR. Our data indicates that Gata4 and Sp1 activate EpoR mRNA expression in cardiomyocytes. This is a novel mechanism that differs from EpoR regulation in neurons and hematopoietic cells. Additionally, the study may suggests, that Gata4 is essentiell for the preservation of normal EpoR levels and thereby for the cardioprotection by rEpo.