Authentic full-length immunoglobulin light chains: Characterization, aggregation behavior & drug intervention: Or about chasing dragons

Abstract

AL amyloidosis and multiple myeloma (MM) is caused by plasma cells that form a clonal population that produces monoclonal light chains (LC). A clonal population exceeding 10% of all bone marrow plasma cells is considered as MM, a form of bone marrow cancer. Only about 46% of AL patients progress to MM. In contrast to MM AL is defined by amyloid deposits formed by the LC. Amyloid fibrils contain a common cross-β-sheet motif which binds to amyloidophilic dyes like Thioflavin T (ThT). Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) was discovered as a possible therapeutic agent in amyloidosis. It reduced cardiac amyloid deposits in AL patients suggesting its potential as secondary treatment option. The aim of my thesis was to characterize structures and stabilities of authentic amyloidogenic light chains, to analyze their aggregation behavior in vitro, and to investigate EGCG as a possible treatment against amyloidogenic deposits in patients suffering from AL. I isolated nine LC proteins (2x κ-AL, 2x λ-AL, 2x κ-AL, 3x λ-AL) from patient’s urine. SDS-PAGE resolved LC into monomers and disulfide-linked dimers. Thermal and chemical stabilities of LC proteins correlated weakly to MM or AL, suggesting that kinetic factors might determine amyloid formation. All light chains formed ThT-positive high molecular weight aggregates. Aggregation kinetics displayed two distinct phases. The first aggregation phase was initiated by reduction of inter- molecular disulfide bonds. It corresponded to conversion into oligomers, while the second phase corresponded to cross-β-sheets formation. At low LC concentrations, all aggregation kinetics showed only weak concentration dependence, suggesting that a conformational change was rate-limiting. At higher concentrations AL-LC, but not MM-LC displayed, concentration dependence typical for amyloid formation kinetics. EGCG inhibited the second aggregation phase and induced SDS-stable aggregates in all nine LC. Glycosylation of one LC did not affect its aggregation. In addition to the analysis of LC aggregation I determined the sequence of one LC (λ-AL-1) via mass spectrometry. I advanced the previously described base peak interrogation method, which infers LC peptide sequences after combined peptide mapping and de novo sequencing from LC-MS/MS data: To confidently determine the sequence of the λ-AL-1 LC an IMGT-derived germline LC sequence database, alignment to the IMGT numbering system, and a scoring system for sequence quality were introduced. I identified 10 mutations of the λ-AL-1 LC compared to its germline parent. Strikingly, most of these mutations lay at the protein- protein interface inside the LC-dimers. This supports my interpretation of the kinetic data that conformational change rather than self-assembly determines LC amyloid formation.

Sowohl AL Amyloidose als auch Multiples Myelom (MM) werden durch klonale Plasmazellen verursacht, die monoklonale Leichtketten produzieren. Diese klonalen Plasmazellen gelten als MM, sobald sie einen Anteil von über 10% des Knochenmarks ausmachen. Dies ist jedoch nur bei 46% der AL-Patienten der Fall. Deshalb wird für die Diagnose AL das Vorhandensein von amyloiden Proteinablagerungen herangezogen. Diese Ablagerungen besitzen ein cross-β-Faltblatt Motiv, an welches spezifische Farbstoffe wie Thioflavin T (ThT) binden können. Das Polyphenol Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), das an das selbe cross-β-Faltblatt Motiv bindet, ist ein möglicher Wirkstoff zur Behandlung von AL. EGCG war in der Lage Amyloidablagerungen im Herzen einzelner Patienten aufzulösen. Meine Arbeit analysiert die Amyloidbildung von Leichtketten aus dem Urin von AL und MM Patienten und untersucht zudem den mechanistischen Effekt von EGCG auf die Leichtkettenaggregation. Dazu wurden sowohl die Struktur und Stabilität von Leichtketten als auch ihr Aggregationsmechanismus untersucht. Zunächst habe ich ein Protokoll zur Isolierung von neun Leichtkettenproteine (2x κ-AL, 2x λ-AL, 2x κ-AL, 3x λ-AL) aus dem Urin von AL- und MM-Patienten etabliert. Die aufgereinigten Leichtketten lagen zu 50% als Monomere und zu 50% als Disulfid-verbrückte Dimere vor. Ihre Stabilität korrelierte in der thermischen und chemischen Denaturierung nur schwach zur Diagnose MM oder AL, was nahelegt, dass die unterschiedliche Aggregation von AL und MM Leichtketten in vivo auf kinetische Faktoren zurückzuführen ist. In vitro formten sowohl AL- als auch MM- Leichtketten ThT-bindende Aggregate in einer zweiphasigen Aggregationskinetik. Voraussetzung für die erste Phase war die Reduzierung intermolekularer Disulfidbrücken. Hierbei wandelten sich monomere Leichtketten in aggregationsfähige Oligomere um. In der zweiten Phase bildete das Protein cross-β-Faltblätter. Dabei hing die erste Phase nicht von der Leichkettenkonzentration ab. Dies deutet darauf hin, dass hier eine Konformationsänderung geschwindigkeitsbestimmend ist. Im Gegensatz zu MM- Leichtketten, war die zweite Aggregationsphase von AL-Leichketten abhängig von der Leichtkettenkonzentration. EGCG inhibierte die zweite Aggregationsphase aller neun Leichtketten und induzierte SDS-stabile Aggregate. Die Glykosylierung einer Leichtkette hatte keinen Einfluss auf deren Aggregationsverhalten. Weiterhin habe ich ein massenspektrometrisches Verfahren zur Sequenzierung von Leichtketten weiterentwickelt. Mittels Basispeak-Abfrage und de novo Sequenzierung assistiertem Peptidmapping in einer IMGT-abgeleiteten LC-Sequenzdatenbank konnte ich die Sequenz der λ-AL-1 Leichtkette und ihre Sequenzgüte zuverlässig bestimmen. Ich konnte 10 Mutationen im Vergleich zum Genvorläufer bestimmen, von denen viele im Protein-Protein-Interface innerhalb von LC Dimeren lagen. Dies stützt meine Interpretation, das eine Konformationsänderung der Bildung von LC-Amyloid bestimmt