Die Analyse der IL-4-Expressionsheterogenität in differenzierten Th2-Zellen

Abstract

Interleukin-4 spielt als zentrales Zytokin der Th2-vermittelten Immunantwort sowohl eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung und Differenzierung von Th2-Effektorzellen als auch bei der Vermittlung wichtiger Th2-Effektorfunktionen. Eine Dysregulation der IL-4-Expression steht dabei in pathogenetischem Zusammenhang mit der Entstehung allergischer Erkrankungen wie Asthma bronchiale und anaphylaktischen Reaktionen. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel dieser Arbeit, die stochastische Regulation der IL-4-Expression in differenzierten Th2-Zellen, insbesondere den Status der Transkriptionsfaktorbesetzung am IL-4-Lokus in IL-4-produzierenden und IL-4-nichtproduzierenden Th2-Zellen, zu analysieren, um damit ein tiefergehenderes Verständnis der komplexen IL-4-Regulation auf molekularer Ebene zu erhalten. Für die Untersuchungen wurde dafür ein etabliertes Th2-in- vitro-Modellsystem verwendet, dass die Analyse der IL-4-Expressionsregulation in differenzierten Th2-Zellen erlaubt. Mittels der magnetischen Chromatin- Immunopräzipitation konnte dabei zunächst gezeigt werden, dass nach Aktivierung differenzierter Th2-Zellen ein Transkriptionsfaktorkomplex, bestehend aus den Faktoren NFAT1, NFAT2, NF-κB/p65, c-MAF, p300, SWI/SNF/Brg1 und GATA-3, transient an den IL-4-Promoter/CIRE-Region und an die HS Va bindet und über die Rekrutierung der RNA-Polymerase-II die IL-4-Transkription induziert. Der Transkriptionsfaktor STAT6 ist hingegen sowohl in ruhenden als auch aktivierten Th2-Zellen konstitutiv mit dem IL-4-Lokus assoziiert. Durch Verwendung des NFAT-spezifischen Inhibitors BTP1 konnte weitergehend demonstriert werden, dass die Rekrutierung des gesamten Transkriptionsfaktorkomplexes an den IL-4-Promoter von der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT abhängig ist. In der Analyse der Transkriptionsfaktorbesetzung in IL-4-produzierenden und IL-4-nichtproduzierenden Th2-Zellen zeigte sich, dass beide Zellpopulationen durch eine äquivalente Expression, Aktivierung und DNA-Bindungsaktivität der NFAT-Faktoren NFAT1 und NFAT2 charakterisiert sind, NFAT1/2 sowie der NFAT- vermittelte Transkriptionsfaktorkomplex jedoch selektiv nur am IL-4-Promoter der IL-4-produzierenden Th2-Zellen gebunden ist. An der HS Va konnte ebenso eine differentielle Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktorkomplexes nachgewiesen werden, wobei jedoch auch IL-4-Nichtproduzenten durch eine im Vergleich zu ruhenden Th2-Zellen geringfügige Transkriptionsfaktorbesetzung gekennzeichnet sind. Für die Transkriptionsfaktoren STAT6 und GATA-3 zeigte sich im Gegensatz dazu eine äquivalente Bindungsaktivität an der IL-4-Promoter -/CIRE-Region bzw. der HS Va. Durch eine genomweite Genexpressionsanalyse konnten verschiedene, zwischen IL-4-produzierenden und IL-4-nichtproduzierenden Th2-Zellen differentiell exprimierte Gene detektiert werden, die einen Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchungen zu den zellbiologischen Mechansismen der stochastischen IL-4-Regulation darstellen. Aus den gewonnenen Erkenntnissen der Transkriptionsfaktorbindungsanalysen wurde zussammenfassend ein molekulares Modell der stochastisch-determinierten IL-4-Expression entworfen. Dieses postuliert die Präsenz eines transkriptionellen Repressors, der spezifisch an den IL-4-Promoter bindet und über die Kompetition mit NFAT um die Bindung an den IL-4-Promoter die stochastische Regulation der IL-4-Expression vermittelt. Diesbezüglich konnte im Rahmen der differentiellen Genexpressionsanalyse der selektiv in den IL-4-nichtproduzierenden Th2-Zellen erhöht exprimierte Faktor Interferon regulatory factor 1 (IRF1) detektiert werden, für den bereits eine Bindung am IL-4-Promoter sowie eine inhibitorische Aktivität im Zusammenhang mit der IL-4-Transkription beschrieben wurde. Der transkriptionelle Repressor IRF1 stellt somit einen möglichen Vermittler der stochastischen Regulation der IL-4-Expression dar und muss diesbezüglich in weiteren Untersuchungen näher analysiert werden.

Interleukin-4 is a central cytokine of the Th2-mediated immune response and is critical for the differentiation of Th2 cells and various Th2 effector functions. A dysregulation of IL-4 expression is often associated with overhelming allergic reactions such as asthma bronchiale or anaphylactic immune reactions. On the cellular level of fully differentiated Th2 effector cells, IL-4 expression is regulated in a stochastic manner. Within a Th2 cell population, only a part of the cells express IL-4 upon T cell receptor stimulation. To get inside into the underlying mechanisms of the phenomenon of IL-4 expression heterogeneity in differentiated Th2 cells we analyzed the transcription factor recruitment to the IL-4-promoter and the hypersensitivity site Va in separated IL-4-producing and IL-4-nonproducing, murine Th2 cells. By using the magnetic chromatin immunoprecipitation method we could show that a protein complex consisting of NFAT1, NFAT2, NF-κB, c-MAF, p300/CBP, SWI/SNF/Brg1, GATA-3 and STAT6 is associated with the IL-4 gene locus and drives the rapid and stimulation-dependent IL-4 transcription . Compared to IL-4-producing Th2 cells, IL-4-nonproducing Th2 cells are characterized by the inability of NFAT1/2 and the other components of the transcriptional complex c-MAF, NF-κB, p300/CBP and SWI/SNF to get associated with the IL-4 gene locus upon restimulation. However, the differential DNA binding activity of the characterized protein complex in IL-4-producing and IL-4-nonproducing Th2 cells is restricted to the IL-4 gene locus. By performing whole genome mRNA expression analysis we could further detect a number of genes differentially expressed in IL-4-producing and IL-4-nonproducing Th2 cells. Based on the differential binding activity of the analysed transcription factor complex and various genes differentially expressed in both Th2 subpopulations we postulate a molecular model for IL-4 expression heterogeneity in differentiated Th2 cells.