G protein-coupled receptors (GPCRs) are important in current pharmacological research, being the target of about 50% of today's drugs. Due to the missing structural data on all GPCRs but rhodopsin, three problems occur in investigations of these receptors. The molecular basis of ligand-binding mechanisms, the intramolecular signal transduction, and the intracellular G protein-interactions are often poorly understood. Due to this, we have studied the interactions of particular GPCRs with their ligands and with their G proteins utilizing homologous receptor subtypes with close sequence similarity but different biological functions. Delineating ligand-binding mechanisms of GPCRs, we focused in the first example on the endothelin receptor subtypes ETA and ETB, which differ in ligand and G protein-selectivity. We studied a collection of 15 endothelin receptor peptide ligands regarding agonism, antagonism, and receptor subtype selectivity. The ligands were dissected into 4 regions: addressor, hook, core and modulator. Ligand binding studies on homology models of ETA and ETB identified 4 ligand-complementary epitopes (gateway, edge, neck, binding cleft) at each receptor. The pairwise interactions of addressor and gateway, hook and edge, core and neck, as well as modulator and binding cleft accurately explain the peptide ligands' selectivity for endothelin receptors and endothelin receptor subtypes. We demonstrated this by the design of a new ETB-selective agonist. As a second example, the nicotinic acid receptor GPR109A and its homologue GPR109B, which is not binding nicotinic acid, were studied. Residues, being critically involved in binding of nicotinic acid to GPR109A, were identified based on homology models of this receptor as well as known nicotinic acid-protein complexes from the PDB (e.g. ferric soybean leghemoglobin). The binding site was predicted to be located between transmembrane helices TMH2, TMH3 and TMH7. This interaction site is different from most other rhodopsin-like GPCRs, where the binding site is located between TMH4, TMH5 and TMH6. Experimental data on mutations of aromatic residues within TMH5, TMH7 and extracellular loop ECL2, which have been predicted by our models, confirm this result. By comparison of the binding sites of nicotinic acid receptor GPR109A and its homologue GPR109B we proposed 2-oxo-octanoic acid as selective ligand for GPR109B but not GPR109A, which was experimentally confirmed. Unraveling the unidentified mechanism of GPCR-G protein interactions, we investigated ligands of different size directly interacting with the G protein-subtypes. A common pattern, consisting of complementary charge distances, was identified to be important in recognition and/or interaction.
In der hier vorliegenden Studie wurden die Interaktionsmechanismen und Hintergruende für selektive Wechselwirkungen zwischen G-Protein gekoppelten Rezeptoren, deren Liganden und G-Proteinen untersucht. Ausgangspunkt dafuer waren homologe Rezeptorsubtypen mit unterschiedlicher biologischer Funktion. Die Ursachen für Selektivitaet und hochaffine Ligandenbindung der Endothelin- Rezeptorsubtypen ETA und ETB war vor der Arbeit nicht aufgeklaert. Basierend auf unseren Untersuchungen, praesentieren wir erstmals Liganden-Rezeptor- Wechselwirkungen, die auf vier unterschiedlichen aber zueinander komplementaeren Erkennungsregionen in Liganden und Rezeptoren beruhen. Paarweise Wechselwirkungen von Addressor und Gateway, Hook und Edge, Core und Neck sowie Modulator und Binding Cleft, erklaeren dabei vollstaendig die Ursachen und Hintergründe der Selektivität für Endothelin-Rezeptoren sowie deren Subtypen, wie wir eindrucksvoll durch die Entwicklung eines neuen ETB- selektiven Peptidliganden zeigen konnten. Desweiteren wurde die Ligandenbindung an Nikotinsaeure-Rezeptoren GPR109A und GPR109B untersucht. Durch die Nutzung der hohen Homologie und der funktionellen Unterschiede war es uns möglich, Aminosaeuren mit kritischer Bedeutung für die Ligandenbindung an beiden Rezeptoren zu identifizieren. Die Bindungsstelle befindet sich zwischen den Transmembran-Helices TMH2, TMH3 und TMH7 und ist somit unterschiedlich zu den meisten anderen rhodopsin-aehnlichen Rezeptoren, deren Bindungstaschen zwischen TMH4, TMH5 und TMH6 liegen. Dass diese Bindungsstelle dennoch richtig identifiziert wurde, bestaetigen experimentelle Ergebnisse von mutierten Aromatenresten in TMH5 und TMH7, die aufgrund unserer Vorschlaege gemacht wurden. Durch die korrekte Identifizierung der Bindungstasche von Nikotinsaeure konnten wir ebenfalls komplementaere pharmakophore Muster zwischen Rezeptor und Ligand ableiten und 2-Oxo-oktansäure als selektiven Liganden für GPR109B identifizieren, was experimentell bestätigt wurde. In einem dritten Projekt wurden die Wechselwirkungen von G-Protein mit deren Interaktionspartnern untersucht. Dabei identifizierten wir ein generelles Muster für G-Protein-Selektivität, welches auf komplementären Ladungsabständen beruht.
