Entwicklung des B-Zellrezeptor-Gen-Repertoires nach Antigenexposition bei Früh- und Reifgeborenen in den ersten postnatalen Wochen

Abstract

Frühgeborene besitzen ein eingeschränktes B-Zellrezeptorrepertoire. Die kombinatorische Vielfalt ist bei Früh- und Reifgeborenen gleich, allerdings besitzen Frühgeborene zum Zeitpunkt der Geburt eine eingeschränkte junktionale Vielfalt. Dies macht ihre verkürzte CDR3-Region deutlich (Zemlin 2001). Die Zunahme der Länge der CDR3-Region scheint genetisch determiniert zu sein, da am errechneten Geburtstermin Frühgeborene (FG) die gleiche junktionale Vielfalt wie Reifgeborene (RG) bei der Geburt aufweisen (Bauer 2002). Nach Antigenkontakt steigen bei FG und RG die Mutationsraten im Vh-Segment an. Bisher gab es noch keine vergleichenden Untersuchungen des Anstieges der Mutationsraten in beiden Gruppen. Im Nabelschnurblut von RG und FG sind nur wenige IgG exprimierende B-Zellen vorhanden (Wedgwood 1997, Bauer 2002). Die Population IgG exprimierender B-Zellen vergrößert sich nach Antigenexposition. In dieser Untersuchung wurde die Entwicklung des Klassenwechseles und die Affinitätsreifung von RG und FG verglichen. Dazu wurden die Diversitäten der IgG-B-Zellrezeptorgene und die Mutationsraten im Vh-Segment der variablen Region des Immunglobulinrezeptorgens im NSB und im peripheren Blut bestimmt. Die mRNA der umgelagerten schweren Ketten der Immunglobu¬linrezptorgens wurde isoliert, durch eine RT-PCR in cDNA umgeschrieben und amplifiziert. Anschießend wurde sie kloniert und sequenziert. Die einzelnen Sequenzen wurden computergestützt ausgewertet. Insgesamt wurden 636 Sequenzen von 8 FG ( 24-27 SSW), 5 RG, 11 reifgeborenen Säuglingen und 4 Erwachsenen untersucht. Bei den FG wurden im Verlauf ein bis drei Proben entnommen. Die Diversität (Anteil der unterschiedlichen Gene an der Gesamtzahl der sequenzierten Gene eines Patienten) ist bei der Geburt bei RG und FG gering. Sie liegt im Median bei 32% bei den 4 Reifgeborenen und bei 27% bei den 4 Frühgeborenen. Sie steigt nach Antigenkontakt an. Bei den FG kommt es zu einer verzögerten Entwicklung der Diversität. Nach 8 Tagen weisen alle Reifgeborenen eine Diversität von über 80% auf. Frühgeborene besitzen erst in einem Alter von 10 Wochen vergleichbare Werte. Im Nabelschnurblut kommen sowohl bei RG als auch bei FG Mutationen nur selten vor. Nach Antigenexposition kommt es im Vh-Segment zum Anstieg der Mutationsraten. Bei den RG ist der Anstieg schneller. Beide erreichen nach 16 Wochen jedoch nicht die Mutationsraten von Erwachsenen. Ebenfalls weisen Reifgeborene früher Sequenzen mit multiplen Mutationen auf. Der Anteil der Sequenzen mit mehr als drei Mutationen nimmt bei Reifgeborenen schneller zu. Die Ursache für die verzögerte Entwicklung der Diversitäten und damit des Klassenwechsels und die verzögerte Affinitätsreifung bei FG können in der Unreife von B- und T-Zellen sowie in einer verminderten Antigenexposition von FG liegen. Ein wichtiges Signal für die Induktion des Klassenwechsels ist die Interaktion zwischen dem CD40-Ligand auf T-Zellen und dem CD-40-Molekül auf B-Zellen (Jumper 1994). Eine verminderte Expression von CD40L auf T-Zellen von Frühgeborenen könnte eine Ursache für den verminderten Klassenwechsel sein. Auch eine verminderte Zytokinproduktion von FG kommt in Frage. Das Enzym AID (activation induced deaminase) spielt sowohl beim Klassenwechsel als auch bei der Affinitätsreifung eine zentrale Rolle. Eine verminderte Aktivität diese Enzyms in B-Zellen Frühgeborener würde das Defizit bei FG er¬klären. So ist neben dem eingeschränkten IgG-B-Zellrezeptorrepertoire bei FG auch die Immunantwort nach Antigenkontakt verzögert. Frühgeborene Kinder können somit nur eingeschränkt auf Infektionen reagieren. Infektionen können daher schwerwiegender verlaufen.

Preterm infants posess a reduced repertoire of B-cell receptors. Their combinatoric diversity is similar to that of term infants, but preterms show a reduced junctional diversity at their time of birth, as is represented by a shorter CDR3 region (Zemlin 2001). The growth of the CDR3-region seems to be genetically determined, because terms (t) and preterms (p) posess a similar junctional diversity at their calculated time of birth (Bauer, 2002). After antigen contact, the rate of mutations in the Vh-segment increases clearly. Until now, there haven t been presented any comparative studies concerning the development of mutation rates of term and preterm infants. In this study, we therefore compare the development of class-switching and affinity maturation of terms and pretems. The amount of IgG expressing B-cells (BC) in cord blood is normally quite low (Wedgwood 1997, Bauer, 2002). But this population increases after antigen exposure. We have analysed the diversity and the mutation rates of the variable region of the BCR-gene s Vh-segments. BC were derived either from cord blood or from peripheral blood. mRNA of rearranged heavy chains of immunolglobulin-receptor genes has been isolated, transcribed into cDNA and amplificated by RT-PCR. The cDNA has then been cloned, sequenced and analysed electronically. In total, 636 sequences of 8 pre-terms (24-27th weeks of pregnancy), 5 terms, 11 mature-born sucklings and 4 adults have been analysed. It was possible to take blood samples from the preterm infants at three successive time points. The amount of different genes compared to the total of sequenced genes of a patient (diversity) is both for term and pre- term infants at the time of birth low, compared to adults (t: median = 32 % diversity, p: median = 27 %). After antigen exposition, this diversity clearly increases. In preterm infants, the development of diversity is slowed down: All term infants included in this study show a diversity of 80 %, but strikingly preterm infants possess this amount of diversity much later, it can be forst detected the age of 10 weeks. Mutations in B-cells of cord blood occur seldom in both groups. The mutation rate of the VH segment increases after antigen exposure, this development is faster in t. infants than in p. infants. But even after 16 weeks both groups do not reach the value of adults. The number of sequences with multiple mutations (three and more) is also higher and increases faster in t. infants than in p. infants. One possible reason for the slower development of diversity, of the time of antibody class- switching and for the retarded affinity maturation could either be the immaturity of B- and T-cells of preterm infants or their reduced exposition to antigen. A reduced expression of CD40-L on T-cells of preterm infants could also be the cause, since triggering of CD40 on B-cells is an inportant signal for the induction of the class-switch (Jumper, 1994). Another possible cause could be a reduced production of certain cytokines. The enzyme activation induced deamidase (AID) plays a role in both f class-switching and affinity maturation of B-cell receptors. Thus a reduced activity of this enzyme in B-cells of preterm infants would also provide a good explanation for our results. Iin conclusion this report provides evidence that preterm infants possess a limited repertoire of B-cell receptors and in addition a retarded activation of the adaptive immune response due to a delayed occuring class- switch . Therefore these patients are limited in their reaction to infections. Infections at this age might thus occure more severe.