The impact of Toll-like receptor activation on neuroinflammation and neurodegeneration in the central nervous system

Abstract

The innate immune system detects a diverse range of pathogen- and host-derived molecules, such as cell wall components, nucleic acids and heat shock proteins via the Toll-like receptors (TLRs). TLRs are present in the central nervous system (CNS), predominantly expressed in microglia, the major immune cells of the brain. Increasing evidence suggests that TLRs play a crucial role in CNS pathologies, such as infection, stroke and classical neurodegenerative diseases. This thesis describes the consequences of TLR activation in the CNS. Highly specific ligands for TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 were used to address the TLR's individual impact on neuroinflammation and –degeneration. In addition, combined TLR activation was assessed, as it can be assumed that in both physiological and pathological states of the CNS, more than one TLR ligand is present and multiple TLRs are activated. In vitro, activation of TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 with their specific exogenous ligands resulted in the microglia- mediated release of inflammatory molecules. Combined TLR stimulation of TLR4 with TLR2 and TLR4 with TLR9 resulted in an increased release of TNF-alpha, IL-6, IL-10 and nitric oxide compared to activation of the respective single TLR. In contrast, additional activation of TLR7 suppressed the inflammatory response mediated by TLR2, TLR4, or TLR9, indicating that TLRs individually modulate the immune response. In co-cultures of neurons and microglia activation of TLRs resulted in neuronal cell injury, whereas only the combination of TLR4 with TLR2 led to significantly more neuronal cell death compared to activation of each TLR alone. When replacing the exogenous ligand of TLR4 with the endogenous ligand heat shock protein 60 (HSP60), combined activation of TLR4 with TLR7 resulted in an increased loss of neurons compared to single TLR activation, indicating diverging events subsequent of TLR4 activation. In vivo, the impact of TLR activation in the murine brain was evaluated after intrathecal injection of the exogenous ligands for TLR2, TLR4, TLR7 or TLR9. Activation of each TLR led to a distinct change in mRNA expression levels of TLR1-9. Activation of TLR2, TLR7 and TLR9 caused axonal and neuronal cell loss in the cerebral cortex, in part accompanied by microglia displaying an activated morphology, by the influx of leukocytes into the cerebrospinal fluid (CSF) and by elevated levels of TNF-alpha and IL-1beta mRNA. Intrathecal injection of HSP60 caused TLR4-dependent neuronal cell death and axonal injury, as well as demyelination and loss of oligodendrocytes in the cerebral cortex. In contrast to the exogenous ligand of TLR4, intrathecal HSP60 did not induce a measurable inflammatory response in the murine brain. Immunohistological analysis of brain sections from naïve mice revealed an expression of HSP60, predominantly in neurons. Moreover, elevated levels of HSP60 were detected in the CSF of mice subjected to a middle cerebral artery occlusion, indicating a release of HSP60 during brain injury and a mechanism by which TLR4 is exposed to HSP60 in CNS pathologies. These findings demonstrate that sole and combined activation of TLRs modify the pattern and extent of TLR expression, of inflammation and of neuronal cell injury in the CNS, mechanisms by which the intrinsic innate immunity might co-determine the diversity of CNS diseases. Further, the release of endogenous TLR ligands during CNS cell damage bi-directionally links CNS injury to neurodegeneration and demyelination in vivo.

Toll-like Rezeptoren (TLR) detektieren pathogen- und wirtspezifische Moleküle, wie z.B. Zellwandkomponenten, Nukleinsäuren und Hitzeschockproteine. Im zentralen Nervensystem (ZNS) werden TLR vorwiegend von Mikroglia exprimiert. Es gibt zunehmend Hinweise dafür, dass TLR eine wichtige Rolle in ZNS- Erkrankungen, wie Infektionen, Schlaganfall und klassischen neurodegenerativen Erkrankungen, spielen. In dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss die spezifische Aktivierung einzelner sowie mehrerer TLR auf neuroinflammatorische und -degenerative Prozesse im ZNS hat. In vitro induzierte die Aktivierung von TLR2, TLR4, TLR7 und TLR9 mit ihren jeweiligen spezifischen exogenen Liganden eine Mikroglia-vermittelte Freisetzung inflammatorischer Moleküle. Darüber hinaus führte die kombinierte Aktivierung von TLR4 mit TLR2 und TLR4 mit TLR9 zu einer vermehrten Sezernierung von TNF-alpha, IL-6, IL-10 und Stickstoffmonoxid. Im Gegensatz dazu, unterdrückte die gleichzeitige Aktivierung von TLR7, die TLR2-, TLR4- und TLR9-induzierte inflammatorische Antwort. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TLR die Immunantwort individuell beeinflussen. In Kokulturen bestehend aus Neuronen und Mikroglia, führte eine Aktivierung der einzelnen TLR zu neuronalem Zelltod, der bei einer gemeinsamen Aktivierung von TLR4 und TLR2 signifikant zunahm. Wohingegen bei der Verwendung des endogenen Liganden von TLR4, dem Hitzeschockprotein 60 (HSP60), eine gemeinsamen Aktivierung von TLR4 und TLR7 zu einem vermehrten Verlust von Neuronen führte. Dies deutet auf unterschiedliche, durch TLR4-induzierte, Signalkaskaden hin. In vivo wurde der Einfluss einer TLR- Aktivierung auf das murine Gehirn nach einer intrathekalen Injektion der jeweiligen Liganden für TLR2, TLR4, TLR7 und TLR9 untersucht. Die Aktivierung der einzelnen TLR veränderte die mRNA Expressionsmuster von TLR1-9. Zudem führte die Aktivierung von TLR2, TLR7 und TLR9 zu einem Verlust von Neuronen und Axonen im zerebralen Kortex. Diese Schädigung wurde zum Teil von einer neuroinflammatorischen Antwort begleitet, die durch eine Aktivierung von Mikroglia, einer Infiltration von Leukozyten in die zerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) und einer Zunahme an TNF-alpha und IL-1beta mRNA gekennzeichnet war. Die intrathekale Injektion von HSP60 resultierte in einer TLR4-abhängigen Schädigung von Axone, dem Verlust von Neuronen und Oligodendrozyten sowie in einer Demyelinisierung im zerebralen Kortex. Es wurde jedoch keine messbare inflammatorische Antwort hervorgerufen. Eine endogene Expression von HSP60 konnte im zerebralen Kortex naïver Mäuse überwiegend in Neuronen festgestellt werden. Zudem konnte im CSF von Mäusen mit einem zerebralen Schlaganfall eine erhöhte Menge an HSP60 nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass sowohl die alleinige als auch die kombinierte Aktivierung von TLR die TLR-Expression beeinflussen, sowie eine Entzündung und Schädigung im ZNS hervorrufen kann. Auf diese Weise könnte das angeborene Immunsystem für die diversen Ausprägungen von ZNS Erkrankungen mitverantwortlich sein. Des Weiteren stellen endogene TLR Liganden, die im Zuge einer Verletzung des ZNS freigesetzt werden, eine bidirektionale Verbindung zwischen ZNS-Schädigung einerseits und Neurodegeneration und Demyelinisierung andererseits her.