RECK-Methylierung im Nierenzellkarzinom

Abstract

Einleitung: Das RECK-Gen (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) erfüllt Aufgaben in physiologischen (z.B. Neuralrohrentwicklung [11]) sowie pathophysiologischen Entwicklungsabläufen. Es fungiert als Inhibitor der Metalloproteinasen MMP-2,-9 und -14 [14]. Diese wirken in verschiedenen geweblichen Umwandlungsprozessen und haben eine entscheidende Bedeutung in der Tumorgenese. Eine verminderte Expression von RECK wurde in verschiedenen Karzinomtypen nachgewiesen [27, 28, 29, 30] und eine Auswirkung auf das Karzinomwachstum konnte aufgezeigt werden. Die Regulation von RECK scheint über verschiedene Wege beeinflusst zu werden, erfolgt aber vor allem über eine Bindung an die Sp1 Seite des RECK-Gen-Promotors [11]. Wie im Kolonkarzinom [31] sowie weiteren Karzinomtypen [28, 32, 33], nachgewiesen, führt auch eine Hypermethylierung im RECK-Gen-Promotorbereich zu einer verringerten Gen- Expression. Signifikante Zusammenhänge konnten zur lymphogenen Metastasierung [28], Tumorinvasionstiefe [33] sowie zum rezidivfreien Überleben und Gesamtüberleben [32] gefunden werden. Der Einfluss einer Hypermethylierung des RECK-Gen-Promotors auf das Tumorwachstum im Nierenzellkarzinom (NZK) wird diskutiert. Das Ziel der folgenden Untersuchung war daher die Messung der RECK-Gen-Promotor-Methylierung. Methoden: Für die Versuche wurden 33 Proben von Nierenzellkarzinomgewebe und tumorfreiem Gewebe, welches den Tumor umgab, verwendet. Durch eine Sodium Bisulfitreaktion wurden mögliche methylierte Cytosin-Reste im Gen- Promotor aufgedeckt. Die RECK-Promotor-Methylierung wurde mit methylierungs spezifischer PCR (MSP) mittels Real-Time PCR ((LightCycler) bestimmt. Mit der Verwendung von beta Actin (ACTB) als methylierungsunabhängiges Referenzgen wurden die einzelnen Methylierungsmesswerte relativiert. Analyse: Die RECK-Methylierung im Tumor- Gewebe sowie in gesundem Gewebe, welches den Tumor umgibt, wurde mit der Verwendung der GraphPad Prism® Software mittels Wilcoxon Tests analysiert. Es wurde versucht eine Korrelation sowie Assoziation zwischen den einzelnen klinisch pathologischen patientenbezogenen (Alter, Geschlecht) sowie tumordefinierenden Daten (Tumorwachstumstiefe, Grading) und der Höhe der RECK- Methylierung darzustellen. Mit der Kaplan-Meier Analyse wurde ein Einfluss der RECK-Promotor-Methylierung auf das postoperative Überleben sowie die postoperative überlebensfreie Zeit untersucht. Ergebnisse: Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Promotor-Methylierung im Tumor Gewebe sowie in tumorfreiem Gewebe, welches den Tumor umgab, nachgewiesen (pWert: 0,851). Eine signifikante Korrelation sowie Assoziation der Methylierung zu Tumor definierenden und patientenspezifischen Daten wurde in unseren 33 Proben ausgeschlossen. Kaplan-Meier zeigte, dass die Methylierung keinen Einfluss auf postoperatives Überleben sowie die postoperative überlebensfreie Zeit hatte. Schlussfolgerung: Mit unserem limitierten Datensatz konnten wir nicht zeigen, dass die RECK-Promotor-Methylierung einen wichtigen Einfluss auf die Entstehung des Nierenzellkarzinoms hat. Andere Wege, die zu verminderter RECK- Expression führen sind bekannt und sollten in nachfolgenden Arbeiten auch im Nierenzellkarzinom untersucht werden.

Introdution: The RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) gene functions in physiological [11] and pathophysiological development as an inhibitor of metalloproteinases (MMP) 2,-9 and 14 [14]. The MMPs take part in tissue metamorphosis and play an important role in tumorigenesis. Reduced expression of RECK is described for different carcinomas [27, 28, 29, 30] and its influence on developmet of carcinoma is shown. Gene regulation of RECK itself is influenced on different ways among them SP1 for which a binding site is present in the promoter [11]. Hypermethylation of the RECK promotor leads to reduced gene expression, as shown for colon [31] and other carcinomas [28, 32, 33]. In addition, a significant correlation to lymphogenous metastasis [28], invasive tumour growth [33] and relapse-free survival and overall survival [32] was found. A possible contribution of hypermethylation of the RECK promotor in renal cell carcinomas (RCCs) to renal carcinogenesis is under discussion. We aimed to clarify this question by measurement of reck gene promotor methylation. Methods: Genomic DNA of 33 RCC tissues and tumor surounding tissue was used. A sodium bisulfite modification was carried out to uncover possible methylated cytosine residues. RECK promoter hypermethylation (PM) was assessed by methylation-specific PCR (MSP) using real-time PCR equipment (LightCycler). Using beta-actin (ACTB) as a methylation independent reference gene we were able to quantify for the ratio of methylated cells in the respective samples. Analysis: Original MSP data of tumor and tumor surrounding tissue were further analyzed using Wilcoxon test provided by GraphPad Prism® software. In addition we tried to establish a correlation and assoziation between the degree of methylation and tumour defining (invasive tumor growth, grading) and patient- specific data (age, gender). Kaplan-Meier analyses was used to estimate the influence of RECK-PM on relapse-free survival and overall survival. Results: There was no significant difference of methylation in tumor promotor dna and the surrounding tissue dna (p = 0,851). No significant correlation or association of promotor methylation and tumour defining and patientspecific data was found in our limited data set of 33 patients. Kaplan-Meier analysis did not show any influence on relapse-free survival and overall survival. Conclusion: With our limited data set we were not able to show that RECK- promotor-methylation plays an important role in the etiology of RCCs. Other means of downregulation of RECK (e.g. mutational events) may contribute the renal carcinogenesis and remain to be assessed by additional investigations.