Nachweis des gemischten Dinukleotid-Polyphosphats Adenosin-Guanosin- Triphosphat aus boviner Nebenniere

Abstract

Der essentielle Bluthochdruck ist in seiner Genese noch nicht hinreichend geklärt. Es gibt eine Vielzahl verschiedener Ansätze, die Ursachen des Bluthochdrucks zu erforschen und Mediatoren zu identifizieren, die den Blutdruck beeinflussen. In diesem Zusammenhang wurden Dinukleotid- Polyphosphate und im besonderen Diadenosin-Polyphosphate beschrieben. In dieser Arbeit wird ein Verfahren vorgestellt, die Substanz Adenosin-Guanosin- Triphosphat aus Rindernebennierengewebe zu isolieren. Im ersten Schritt wurde aus reinem Rindernebennierengewebe mit Hilfe eines anerkannten Verfahrens ein Homogenat hergestellt, das dann unterschiedlichen chemisch-physikalischen Aufbereitungsschritten unterzogen wurde. Zuerst erfolgte in der präparativen Reversed-Phase-Chromatographie eine Abtrennung sehr hydrophiler und hydrophober Substanzen. Anschließend wurde das Eluat in der Größenausschluss- Chromatographie bezüglich der molekularen Größe weiter fraktioniert. Im nächsten Schritt erfolgte eine Affinitäts-Chromatographie mit Phenolboronsäure, wodurch Dinukleotid-Polyphosphate von Mononukleotid- Polyphosphaten getrennt werden konnten. Das Resultat der Affinitäts- Chromatographie wurde mittels einer Displacement-Chromatographie weiter fraktioniert. In der analytischen Anionenaustausch-Chromatographie wurden die Nukleotide mit mehreren Phosphatgruppen isoliert. Abschließend erfolgte analytische Reversed-Phase-Chromatographie zur weiteren Trennung der Probe von Nebenbestandteilen. Die Fraktionen der analytischen Reversed-Phase- Chromatographie wurden mit MALDI-Massenspektrometrie analysiert. Es wurde eine molekulare Masse von 772,9 DA detektiert. Ein Versuch mit synthetisch hergestelltem Adenosin-Guanosin-Triphosphat und ein Vergleich der Retentionszeiten in der Reversed-Phase-Säule mit Standardwerten bekannter Dinukleotide zeigte ein übereinstimmendes Ergebnis. Die in der PSD-MALDI- Massenspektrometrie gemessenen Massensignale konnten somit Adenosin-Guanosin- Triphosphat zugeordnet werden. Mittels enzymatischer Analytik und anschließender analytischer Anionenaustausch-Chromatographie wurde eine Spaltungsreaktion festgestellt. Die Massen der zwei Ribosen entsprachen denen von Adenosin und Guanosin. Diese waren durch jeweils 1 und 2 Phosphatbrücken miteinander verbunden, deren Phosphoester-Bindungsstellen an der 5´-Position der Ribosen nachgewiesen wurden. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass es sich um die Substanz Adenosin-Guanosin-Triphosphat handelt mit den Molekülen AMP und GDP sowie GMP und ADP. Wie bereits erwähnt, hat Adenosin-Guanosin- Triphosphat Einfluss auf die Blutdruckregulation. Weitere Untersuchungen über das Vorkommen dieser Substanz in menschlichem Gewebe können Rückschlüsse auf die Genese des essentiellen Bluthochdrucks ermöglichen sowie zur Entwicklung neuer Therapieoptionen in der Behandlung des essentiellen Bluthochdruckes führen.

The genesis of essential hypertension still is not not sufficiently understood. There is a huge number of different studies to investigate the causes of the high blood pressure and to identify the etiology which influence the blood pressure. In this conjunction dinucleotide-polyphosphates and in particular diadenosine-polyphosphates were described. In this study a procedure is introduced to isolate the substance adenosine-guanosine- triphosphate from bovine adrenal gland tissue. In the first step, with the help of an approved procedure, a homogenate of pure bovine adrenal gland tissue was assembledand and then submitted to different chemical-physical processing steps. In a preparative reversed-phase-chromatography a separation of highly hydrophilic and hydrophobic substances was achieved. Afterwards the eluate was further fractionated in the dimensions exclusion-chromatography with regard to the molecular size. In the next step an affinity-chromatography followed with phenylic boronic acid by which dinucleotide-polyphosphates could be separated from mononucleotide-polyphosphates. The result of the affinity- chromatography was further fractionated by means of a displacement- chromatography. In the analytic ion-exchange-chromatography the nucleotide with several phosphate teams were isolated. Finally followed by the analytic reversed-phase-chromatography for further separation of minor components. The fractions of the analytic reversed-phase-chromatography were analysed with MALDI-mass-spectrometry. A molecular mass of 772.9 was detected. A study with synthetically produced adenosine-guanosine-triphosphate and a comparison of the retention times in the Reversed phase column with defaults of known dinucleotide showed a correspondent result. The mass signals measured in the PSD-MALDI-mass-spectrometry could be assigned therefore adenosine-guanosine- triphosphate. By means of enzymatic analytics and followed analytic ion- exchange-chromatography a splitting reaction was ascertained. The masses of two riboses corresponded to those of adenosine and guanosine. These were connected by 1 and 2 phosphate bridges in each case with each other whose phosphoester-connection places were proved in 5' positions of the riboses. It can be gathered that the substance is adenosine-guanosine-triphosphate with the molecules AMP and GDP as well as GMP and ADP. As already mentioned, Adenosine-guanosine-triphosphate influence on the blood pressure regularisation. Further investigations about the occurence of this substance in human tissue may allow conclusions on the genesis of the essential high blood pressure as well as lead to the development of new therapy options in the treatment of the essential high blood pressure.