NMR-spektroskopische Untersuchungen an dem ABC-Transporter ArtMP-J aus G. stearothermophilus

Abstract

Zusammenfassung ATP- binding cassette (ABC)-Transporter sind ubiquitäre Membranproteine, die die ATP-Hydrolyse mit der Translokation verschiedenster Substrate über Membranen koppeln. Ein Verständnis des komplexen Transportvorgangs setzt Kenntnisse zu Funktion und Struktur der ABC- Transporter voraus. In der vorliegenden Dissertation wurden erste strukturelle Untersuchungen mit der NMR-Spektroskopie an dem ABC-Transportsystem ArtMP-J aus G. stearothermophilus durchgeführt, die die Grundlage für weiterführende NMR-Strukturstudien schaffen und so langfristig zur Aufklärung der molekularen Mechanismen dieser Transporter beitragen. ArtMP und das isolierte ArtP-Protein wurden mit Festkörper-magic angle spinning (MAS)-NMR strukturell untersucht. Beide wurden für diese Studien jeweils im Nukleotid-gebundenen oder -freien Zustand hergestellt und selektiv mit 13C-, 15N-Prolin, -Tyrosin und -Threonin markiert. Über diese markierten Aminosäuren ließen sich Effekte der Nukleotid- Bindung in ArtMP und ArtP verfolgen. Das lösliche ABC-Protein ArtP wurde separat präpariert und mit und ohne ATP-Zugabe 3D-kristallisiert. Die NMR- Spektren der 3D-Kristalle wiesen eine gute Signalauflösung auf und zeigten den Erfolg der selektiven 13C-, 15N-Markierung ausgewählter Aminosäuren des Proteins. Es wurden zwei Aminosäure-Paare sequentiell zugeordnet: Tyrosin-133/Prolin-134 und Prolin-134/Threonin-164 sowie zusätzlich das Tyrosin-213. In den Spektren vom Nukleotid-gebundenen ArtP war eine Signalaufspaltung von Tyrosin-213 zu beobachten. ArtMP befand sich für die NMR-spektroskopischen Studien homogen angeordnet in seiner natürlichen Lipidumgebung, indem der Proteinkomplex in extrahierte Lipiden von G. stearothermophilus 2D-kristallisiert wurde. Bei der 2D-Kristallisation von ArtMP mit und ohne Nukleotid entstanden verschiedene Formen von 2D-Kristallen, die jeweils gut aufgelöste NMR-Spektren ergaben. Über den Vergleich der ArtMP- mit den ArtP-Spektren wurden die erhaltenen Zuordnungen übertragen und die Signale, die zu den TMDs gehören, identifiziert. An dem zugehörigen Substrat- Bindeprotein ArtJ wurde mittels der Lösungs-NMR-Spektroskopie die Wechselwirkungen zwischen Protein und Transporter sowie Protein und Substrat untersucht. Des Weiteren ermöglichten die NMR-Messungen an ArtJ die Betrachtung der Signalübertragung zwischen den einzelnen Untereinheiten bzw. Komponenten des ABC-Transportsystems.

Summary ATP-binding cassette (ABC) transporters are ubiquitous membrane proteins that couple the energy of ATP hydrolysis to the translocation of diverse substrates across biological membranes. The understanding of the complex translocation mechanism requires the knowledge of both the function and the structure of the ABC-transport systems. This thesis describes first structural studies by NMR spectroscopy of the ABC-import system ArtMP-J from the thermophilic organism G. stearothermophilus in order to gain structural insights into the molecular mechanisms and interactions of ABC transporters. ArtMP and isolated ArtP were structurally analysed by solid-state magic-angle- spinning (MAS) NMR. In recent years solid-state MAS NMR has emerged as a method for structural studies of large proteins and membrane proteins. Solid- state NMR experiments on membrane proteins require reconstitution of purified and isotopically labelled proteins in a membrane environment at high density or three-dimensional crystals of soluble proteins. For these NMR-studies both ArtMP and ArtP were prepared in nucleotide-bound or unbound state and selectively isotopically 13C-, 15N-labelled with the amino acids proline, tyrosine and threonine. Therefore a few sequential pairs of labelled amino acids occurred, which were used to monitor structural changes in the proteins and could be assigned. ArtMP was reconstituted in its native environment using lipids extracted from the host strain G. stearothermophilus. The 2D crystallization with and without ATP resulted in two different shapes of ArtMP 2D crystals when studied by electron microscopy: in the absence of the nucleotide large multilayered structures were formed whereas with ATP the 2D crystals had the shape of vesicles with large regions of lattice-like patches. The solid-state NMR-measurements of these ArtMP-crystals generated spectra with good resolution whereas best spectra were obtained for the nucleotide- bound ArtMP. Additionally, the isolated ArtP domain was prepared and 3D crystallized for solid-state MAS NMR-experiments. The recorded NMR spectra of the ArtP 3D crystals were of high quality with good resolution. Taking advantage of the reduced number of labelled residues two pairs of amino acids were sequence-specifically assigned: Y133/P134 and P163/T164 and furthermore Y213. In the spectra of ArtP in the nucleotide-bound state interesting chemical shift changes and doubling of signals was observed. Structural studies were also performed on the substrate-binding protein, ArtJ, using solution-state NMR. These NMR measurements gained initial insight into the dynamics and interactions of ArtJ with the transported substrate and the ABC transporter. In the future a sequential assignment of the protein enables the determination of amino acids and regions in the protein, which are involved in the protein-protein or protein-ligand contacts.