Steigerung der Effizienz des Escherichia coli in vitro Translationssystems durch Optimierung der Nukleinsäurekomponenten

Abstract

Ziel dieser anwendungsorientierten Arbeit war es, die Templateigenschaften und ihre Herstellung im Hinblick auf die Syntheseleistung des in vitro Translationssystems aus Escherichia coli zu verbessern. Limitierungen der Expressionseffizienz zweier Modellproteine auf der Ebene der Sekundärstruktur einer mRNA, der Translationsinitiation, des Codongebrauchs und der Stabilität einer mRNA sollten aufgezeigt und vermindert werden. Abschließend sollte eine auf die Polymerase Kettenreaktion basierende zeitsparende Methode zur Herstellung von Templaten für die Proteinsynthese entwickelt werden. Es wurde gezeigt, daß die Expressionseffizienz eines Proteins am Übergang von der Translationsinitiation zur Elongation sehr stark vom zweiten Aminosäurecodon abhängt. In diesem Zusammenhang wurden deutliche Indizien für eine Abhängigkeit der Synthese des Fettsäure Bindenden Proteins (H-FABP) von der Stärke einer Sekundärstruktur im Initiationsbereich der mRNA gefunden. Effekte basierend auf der Art der eingebauten Aminosäure und der entsprechenden tRNA wurden dagegen als unwahrscheinlich angesehen. Anhand der Expression von heterogenen Fusionsproteinen aus H-FABP und Dehydrofolatreduktase (DHFR) sowie von Multimeren dieser beiden Proteine konnte festgestellt werden, daß im Gegensatz zu Zellkultursystemen die Translationsinitiation optimierter Template in vitro sehr wahrscheinlich nicht der limitierende Faktor für die Proteinsynthese ist. Dagegen wird die Expression von DHFR entscheidend durch einen Mangel an der seltenen tRNAArgU begrenzt. Die Synthese des Proteins konnte durch Ergänzung des Systems mit in vitro transkribierter tRNA deutlich verbessert werden. Ähnliches gilt für die Expression des lysinreichen Proteins NusA, bei dem die Konzentration der entsprechenden beladenen Lysyl-tRNA als limitierender Faktor identifiziert werden konnte. Die Stabilität der für H-FABP codierenden mRNA steigt mit zunehmender Expression des korrespondierenden Proteins an. Sie wird gleichermaßen erhöht, wenn man die Ribosomen durch die Zugabe von Chloramphenicol blockiert. Dagegen führt das Freisetzen von Ribosomen durch Puromycin zu einer verminderten Stabilität der mRNA. Diese Ergebnisse zeigen, daß allein eine Bedeckung des translatierten Bereichs der mRNA mit Ribosomen stabilisierend wirkt. Die Stabilität der mRNA nimmt auch mit der Ausprägung einer definierten Sekundärstruktur und zunehmender Länge im 3?-nicht-translatierten Bereich zu. Eine früher veröffentlichte translationsunspezifische, die mRNA stabilisierende Wirkung von Chloramphenicol konnte bestätigt, einige hierfür vorgeschlagene Mechanismen jedoch ausgeschlossen werden. Schließlich wurde eine Methode zur schnellen Amplifikation kleinster Mengen einer Gensequenz aus einem komplexen DNA-Gemisch bei gleichzeitiger Einführung von prokaryontischen Regulationssequenzen für die zellfreie Proteinbiosynthese entwickelt und optimiert. Am Modellsystem der Expressions-Polymerase Kettenreaktion für die Synthese von H-FABP wurde gezeigt, daß ein auf diese Weise hergestelltes PCR-Produkt ebenso effizient exprimiert werden kann wie ein bereits optimiertes Plasmid. Die Methode stellt eine enorme Zeitersparnis der Expression vor allem neu gefundener Gene dar und hat darüberhinaus den Vorteil, daß nicht mit gentechnisch veränderten Organismen gearbeitetet werden muß.

The goal of this work, which was designed to be applied in the field of biotechnology, was to improve the properties and the construction of templates with regard to the efficiency in an Escherichia coli in vitro translation system. Limitations of the expression efficiency on the level of the secondary structure, the translational initiation, the codon usage and the stability of a mRNA were planed to be exhibited and reduced. Finally a time saving method based on the polymerase chain reaction for the generation of templates for the protein synthesis was planed to be developed. It was shown, that the expression efficiency of a protein at the crossing point from the translational initiation to the elongation strongly depends on the second amino acid codon. In this connection, some evidence was found to support the suggestion that the synthesis of the fatty acid binding protein (H-FABP) depends on the strength of a secondary structure of the mRNA within the translational initiation region. Effects based on the kind of the incorporated amino acid and the corresponding tRNA could be ignored as a consideration. By means of the expression of heterogeneous fusion proteins consisting of H-FABP and dehydrofolate reductase (DHFR) as well as multimeres of these proteins it was shown that in contrast to cell culture systems the in vitro translational initiation of optimized mRNAs is unlikely to be the rate limiting step of the protein synthesis. In comparison, the expression of DHFR is strongly limited by the rare tRNAArgU. The synthesis of the protein could by clearly improved by supplementation of the system with in vitro transcribed tRNA. A similar effect was observed in the expression of the NusA protein, which has a high content of lysyl codons. The concentration of the corresponding aminoacyl-tRNA could be identified as a limiting factor. The stability of the mRNA coding for H-FABP increases with increasing expression of the corresponding protein. The stability is increased in the same way by blocking the ribosomes by means of the addition of chloramphenicol. In comparison, stripping the ribosomes of the mRNA leads to reduced stability. These results show, that just the covering of the translated region of the mRNA has a protective effect. The stability of the mRNA also increases with the strength and an increasing length of the 3?-untranslated region. A previously published translation-independent effect of chloramphenicol could be confirmed. However, some of the suggested mechanisms in this connection could be ignored as a consideration. Finally, a method for the fast amplification of small amounts of gen sequences out of complex DNA mixtures including a simultaneous introduction of procaryotic regulatory elements for the efficient cell-free protein synthesis was developed and optimized. Illustrated by the example of the expression- polymerase chain reaction for H-FABP it was shown, that a PCR product produced in this way can be as eficiently expressed as a an optimized plasmid template. The method described here represents a time saving for the expression of newly found genes. Moreover the method has the advantage, that there is no need for working with genetic engineered organisms.