Etablierung eines caprinen Infektionsmodells für die Paratuberkulose sowie Nachweis und Charakteristik der spezifischen Immunantwort gegenüber Mycobacterium avium spp. paratuberculosis (MAP) unter Berücksichtigung verschiedener diagnostischer Fragestellungen

Abstract

Die Diagnostik in Frühstadien der Paratuberkulose ist nicht sicher möglich. Dies beruht auf dem unzureichenden Verständnis der Pathogenese der Erkrankung. Es fehlen außerdem sensitive und spezifische diagnostische Methoden. Als potentieller Test gilt der IFN-y-Assay, für den jedoch spezifische Restimulationsantigene fehlen. Es ist unbekannt, ob sich weitere Zytokine für die Diagnostik eignen. Um pathogenetische Fragestellungen zu beantworten und diagnostische Tests zu entwickeln und zu evaluieren, sollte ein sicheres, international vergleichbares Langzeitinfektionsmodell an der Thüringer Wald Ziege entwickelt und ein geeigneter Inokulationsmodus gefunden werden. Die Studie diente auch dazu, die zelluläre und humorale Immunantwort zu charakterisieren und Zusammenhänge zur Ausscheidung des Erregers und den pathohistologischen Befunden darzustellen. Insbesondere der Übergang von der zellulären zur humoralen Immunantwort war von Interesse. Weiterhin sollte die Sensitivität des IFN-y-Tests durch Neutralisation von IL-10 verbessert werden. Es wurden vier rekombinant hergestellte MAP-Proteine auf ihre Eignung als spezifische Antigene in diesem Test untersucht. Anhand der Genexpression von IFN-y, IL-10, TNFa, TGFß und IL-12p40 sollten für MAP-Infektionen typische Zytokinmuster erstellt und auf ihre diagnostische Eignung untersucht werden. Es wurde ein Infektionsmodell etabliert, das internationalen Standards entspricht. Die Infektion gelang bei 96 % der Versuchstiere. Die gewählten Inokulationsdosen (Unterschied um den Faktor zwei) führten ebenso wie die gewählten Inokulationszeitpunkte (Abstand von 29 Tagen innerhalb der ersten vier Lebenswochen) nicht zu Unterschieden in der Erregerausscheidung und der zellulären und humoralen Immunantwort. Die frühe Inokulation mit der höheren Dosis bewirkte bei einigen Tieren möglicherweise einen Thiaminmangel. Nach einer passiven Ausscheidung über vier Wochen p. i. wurden drei verschiedene fäkale Ausscheidungsprofile nachgewiesen: 1\. eine kontinuierliche, 2. eine intermittierende und 3. eine während der Versuchsdauer sistierende MAP- Ausscheidung mit dem Kot. Die Inokulation führte zu einer schnellen IFN-y-Reaktion, die ab der zweiten Versuchshälfte sank. Die Antikörperproduktion stieg nur wenig später an und verlief parallel zur IFN-y-Reaktion. Drei Tiere bildeten keine Antikörper. Die immunologischen Reaktionen waren durch große individuelle Schwankungen gekennzeichnet. Bei einer Ziege war retrospektiv keine Infektion aber eine IFN-y- und Antikörperreaktion nachweisbar. Tiere mit schweren Läsionen schieden mehr Erreger aus und wiesen in der zweiten Versuchshälfte eine deutlich stärkere Antikörperreaktion auf. Während sich dies als Trend auch für die Intensität der IFN-y-Reaktion nachweisen ließ, unterschied sich ihr Verlauf nicht in Abhängigkeit von der Schwere der pathohistologischen Läsionen. In den ersten 28 Versuchswochen trat unabhängig von der Inokulation eine altersbedingte IL-10-Induktion auf. Im Anschluss unterschied sich die sekretierte Menge IL-10 nicht zwischen Versuchs- und Kontrolltieren. Selbst die Neutralisation dieser geringen IL-10-Mengen in Zellkulturüberständen bewirkte eine Steigerung der IFN-y-Konzentration im IFN-y-Assay. Die vier untersuchten rekombinanten MAP- Proteine induzierten keine spezifische IFN-y-Reaktion, aufgrund einer Kontamination mit LPS jedoch unspezifisch IL-10. Die Genexpression zwischen infizierten und nicht infizierten Ziegen unterschied sich nur für IFN-y signifikant. Ein eindeutig für die Paratuberkulose spezifisches Zytokinmuster war nicht nachweisbar. Das etablierte Infektionsmodell erwies sich als geeignet pathogenetische Fragestellungen zu beantworten und Diagnostika zu entwickeln und zu evaluieren. Für die Untersuchung pathologischer Fragestellungen, die Feldinfektionen imitieren sollen, sollte die Inokulation ab dem 42. Lebenstag bevorzugt werden. Inokulationsdosen, die sich maximal um den Faktor zwei unterscheiden, reichten nicht aus, um Unterschiede in der Immunreaktion darzustellen. Hohe Infektionsdosen führten zu einer schnellen IFN-y- und Antikörperreaktion. IL-10 hat unter diesen Inokulationsbedingungen keinen Einfluss auf den Übergang von zellulärer zu humoraler Immunantwort. Die Schwere der Läsionen war abhängig von der Stärke der Immunantwort und stand in Relation zur Intensität der Ausscheidung. Aufgrund der parallelen Ausscheidung, Antikörperreaktion und IFN-y-Reaktion ist das „klassische“ Modell der Immunreaktion nicht mehr aufrecht zu erhalten, da es lediglich auf einen Teil infizierter Tiere zutrifft. Es muss in Abhängigkeit von der aufgenommenen Erregermenge von einer individuellen Immunreaktion ausgegangen werden. Eine Überwindung der Infektion ist in Betracht zu ziehen. Die untersuchten rekombinanten MAP-Proteine eigneten sich nicht für den Einsatz im IFN-y-Assay. Der Einsatz IL-10-neutralisierender Antikörper ist zur Sensitivitätserhöhung des Tests empfehlenswert. Der Einsatz des IFN-y-Tests unter Feldbedingungen ist derzeit nicht möglich, da sowohl ein Grenzwert als auch ein Altersfenster für die Beprobung aufgrund der großen Schwankungen in der Immunreaktion nicht angegeben werden können. Weiterhin ist unklar, ob eine frühe IFN-y-Reaktion in Zusammenhang mit einer Überwindung der Infektion steht. Die Diagnostik infizierter Tiere anhand von spezifischen Zykotinmustern ist derzeit nicht möglich.

Today diagnosis of paratuberculosis in early stages of infection is not reliably possible. This is due to limited understanding of the pathogenesis of infection. Sensitive and specific diagnostic methods are missing. A potential diagnostic test is the IFN-y-assay, but there are no specific restimulation antigens available. It is unknown if other cytokines could be used for diagnostic purposes. In this study an internationally comparable and reliable long-time infection model using goats of the breed “Thüringer Wald Ziege” had to be introduced for studying pathogenetic questions and to develop and evaluate diagnostic tests. A reproducible mode of inoculation had to be found. Another aim of the study was to characterize the humoral und cellular immune response and to elucidate relations to shedding of bacteria and the severity of pathohistological lesions. We were especially interested in the switch from cellular to humoral immune response and wether the sensitivity of the IFN-y-assay could be enhanced by neutralizing IL-10. Four recombinant MAP- proteins were tested for their potential as specific restimulation antigens. Gene expression of IFN-y, IL-10, TNFa, TGFß and IL-12p40 was analyzed to demonstrate cytokine profiles specific for paratuberculosis and to prove their diagnostic ability. An infection model was chosen that fulfils international requirements. Infection rate was 96 %. Both doses of inoculation (differing about factor two) and both inoculation times (interval of 29 days during the first four weeks of life) did not result in differences of MAP-excretion, cellular and humoral immune reaction. Early inoculation with the higher dose probably caused a deficiency of thiamine in some goats. After four weeks of passive shedding, three different profiles of faecal excretion could be demonstrated: 1\. continuous, 2. intermittent and 3. ceasing excretion of MAP during the observation period. The inoculation leads to a fast IFN-y-response, which decreased in the second part of the study. The induction of antibodies started shortly after the onset of the IFN-y-response and paralleled it thereafter. There was no antibody detection in three animals. The immune response was hallmarked by strong individual variability. In one goat, no infection could be retrospectively verified but detection of IFN-y and antibodies was possible. Animals presenting severe lesions excreted more MAP and had a stronger antibody reaction in the second half of the study. While the intensitiy of the IFN-y-response showed the same trend, the kinetics of IFN-y did not differ as a function of the severity of pathohistological lesions. During the first 16 weeks of the study an IL-10 induction was measured. It was dependent on age but not on inoculation. After that period IL-10-concentration did not differ between inoculated and control animals. Even neutralisation of such small amount of IL-10 in cell culture supernatants increased IFN-y in the IFN-y-assay. The four tested recombinant MAP-proteins did not induce a specific IFN-y- but an unspecific IL-10 secretion due to contamination with LPS. Genexpression between infected and control goats did only differ for IFN-y. A cytokine profile specific for paratuberculosis was not demonstrated. The infection model presented here was found to be suitable to study pathogenesis of paratuberculosis and to develop and evaluate diagnostic tests. To answer questions regarding pathology that mimics field conditions an inoculation after 42 days of life should be preferred. Doses for inoculation that differ by factor two were not sufficient to show differences in immune response. High doses for inoculation induced an early IFN-y and antibody reaction. Under these conditions of inoculation IL-10 had no influence on the switch from cellular to humoral immune response. Severity of pathohistological lesions depended on the intensity of immune reaction and was related to the amount of excreted MAP. Because faecal shedding, antibody and IFN-y-reaction ran in parallel, the “classic” model of the immune response of paratuberculosis has to be questioned. It just applies for one part of infected individuals. The individual immune reaction is influenced by the ingested amount of MAP. Overcoming the infection can be possible. The four tested recombinant MAP proteins were not suitable to be used in the IFN-y-assay. To enhance sensitivity of this test the use of IL-10 neutralizing antibodies had to be recommended. The IFN-y-assay is currently not applicable under field conditions because there is no reliable cut-off exsistent and the optimal age of testing is unknown due to the great variability of the immune response. It is also unclear if an early IFN-y-response correlates with overcoming the infection. Diagnosis of paratuberculosis using specific cytokine profiles is currently not possible.