Haplotypen des Vitamin-D-Rezeptor-Gens als Suszeptibilitätsfaktoren für das kolorektale Karzinom sowie In-vitro-Expressionsanalyse Vitamin-D-regulierter Gene

Abstract

Die Assoziation von Vitamin-D-Rezeptor-Polymorphismen mit dem Vorkommen von kolorektalen Karzinomen wurde in einer kaukasischen Population untersucht. Die Häufigkeit der Vitamin-D-Rezeptor Polymorphismen 23005G>A (CDX-2), 27823C>T (FokI), 60890G>A (BsmI), 61050G>A (Tru9I), 61888G>T (ApaI) und 61968T>C (TaqI) wurde für 256 Darmkrebspatienten und 256 Patienten ohne maligne Erkrankungen (Fall-Kontroll-Studie) mittels PCR/RFLP-Genotypisierung bestimmt. Haplotypenanalyse wurde auf der Grundlage von 6 genetischen Loci auf die erhaltenen Genotypen angewendet. Das paarweise Kopplungsungleichgewicht zwischen BsmI, ApaI, TaqI und Tru9I konnte bestätigt werden (p<0,001). Die Allelfrequenzen zwischen den Gruppen unterschieden sich nicht. Dennoch waren die Haplotypen BsmI(G)#TaqI(C) und BsmI(A)#TaqI(T) invers assoziiert mit dem Vorkommen von kolorektalem Karzinom (p<0,001), die Chance ist 15 mal (OR 0,067; 95% CI, 0,016-0,284) beziehungsweise 5,3 mal kleiner (OR 0,188; 95% CI, 0,077-0,461), verglichen mit Nicht-Trägern. Unsere Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Vitamin-D-Rezeptor-Haplotypen BsmI(G)#TaqI(C) und BsmI(A)#TaqI(T) einen protektiven Effekt gegenüber kolorektalen Karzinomen haben. Ein weiteres Ziel dieser Studie war, Varianten des Vitamin-D-Rezeptor Mikrosatelliten poly(A) auf ihre Assoziation zum Vorkommen von kolorektalem Karzinom zu untersuchen. Der poly(A) Polymorphismus wurde mit einer Kombination aus GeneScan®- und Sequenzierungs-Analyse bestimmt. Eine deutliche Trennung zwischen langen und kurzen Allelen (bimodale Verteilung) war vorhanden. Es wurden 19, 20, 21 und 22 A-Wiederholungen für die lange Variante und 14 und 15 A-Wiederholungen für die kurze Variante gefunden. Weder die Häufigkeiten der langen und kurzen Allele noch die der Einzelvarianten unterschied sich zwischen Fällen und Kontrollen. Der poly(A) Mikrosatellit befindet sich in starkem Kopplungsungleichgewicht mit den nahegelegenen Loci BsmI, Tru9I, ApaI und TaqI, aber nicht mit den weiter entfernten Loci CDX-2 und FokI. Das Genotyp-Paar poly(A)-TaqI und der komplexe Genotyp poly(A)-TaqI- BsmI waren zwischen Darmkrebspatienten und Kontrollen unterschiedlich verteilt. Die Haplotypenanalyse aller poly(A)-TaqI-BsmI-Kombinationen ergab eine Unterrepräsentation von Darmkrebspatienten in der Gruppe der Individuen mit nicht-kopplungs-konformen Allelen. An der Bildung von Vitamin D (1α,25(OH)2D3,Calcitriol) sind die Hydroxylasen CYP24A1, CYP27A1 und CYP27B1 beteiligt. Es besteht ein Zusammenhang zwischen Vitamin D, Vitamin-D-Stoffwechsel und dem Vitamin-D-Rezeptor und dem Vorkommen und der Entstehung von kolorektalen Karzinomen. Ausgewählte Polymorphismen der Gene CYP24A1, CYP27A1 und CYP27B1 wurden mittels SNPlexTM –Technologie und Sequenzierung an 928 gesunden Kontrollen und Patienten mit kolorektalem Karzinom einer kaukasischen Population aus Deutschland bestimmt. Die Häufigkeiten der Genpolymorphismen des Minor-Allels entsprechen bisherigen Studien an kaukasischen Populationen. Die Allelfrequenzen ergaben keine charakteristischen Unterschiede bezogen auf die Fall-Kontroll-Klassifikation. Keine Variante zeigte signifikante Abweichungen vom Hardy-Weinberg- Gleichgewicht. Haplotypenanalyse und Assoziationstests zwischen komplexen Genotypen und Variantenpaaren ergaben keine signifikanten Unterschiede mit dem Auftreten von kolorektalen Karzinomen. Es besteht eine starkes paarweises Kopplungsungleichgewicht zwischen den Varianten des CYP27B1 Gens (p<0,001). Der Einfluss von Natriumbutyrat, all-trans-Retinsäure und Vitamin D auf die Expression verschiedener Zielgene wurde in zwei Darmkrebszelllinien untersucht. Die humanen Darmkrebszelllinien Caco-2 und SW480 wurden mit Natriumbutyrat, all-trans-Retinsäure und Vitamin D und unterschiedlichen Inkubationszeiten induziert. Nach Isolierung der RNA wurden Real-Time-PCRs für die Gene des Vitamin-D-Rezeptors und E-Cadherin durchgeführt. Der Vitamin-D-Rezeptor und E-Cadherin waren deutlich erhöht nach 6 h, 12 h und 24 h. Vitamin D als physiologischer Induktor zeigte den stärksten Effekt im Caco-2 Zellkultur-Modell. Zur Bestätigung dieser Ergebnisse und zur Klärung der Regulation weiterer Kandidatengene wurde eine GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Mikroarray-Analyse durchgeführt. Erhöhte oder verminderte Expressionen (p<0,01, Fold-Change-Wert>1,5 bzw. <0,67) wurden für mehrere Gene des Fremdstoffmetabolismus z.B. SULT1C2, CYP3A5, CYP24A1, der Calciumhomöostase, des Phosphathaushaltes, des Glucosetransportes und für den Fettsäure- und Steroid-Stoffwechsel z.B. HSPA9, PPARGC1B gefunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Varianten von Vitamin-D-regulierten Genen mit der Inzidenz von kolorektalem Karzinom assoziiert werden konnten und nach Vitamin-D-Behandlung die Expression mittels Zellkulturmodell, RT-PCR und Mikroarray-Analyse unterschiedliche Zielgene des Vitamin-D-Metabolismus reguliert wurden.

The association of vitamin D receptor polymorphisms and colorectal cancer incidence has been investigated in a Caucasian population. The frequencies of the vitamin D receptor gene polymorphisms 23005G>A (CDX-2), 27823C>T (FokI), 60890G>A (BsmI), 61050G>A (Tru9I), 61888G>T (ApaI) and 61968T>C (TaqI) were determined in a series of 256 colorectal cancer patients and 256 patients without malignant disease (case-control study) using polymerase chain reaction- and restriction fragment length polymorphism genotyping assays (PCR/RFLP). Haplotype analysis based on the 6 genetic loci was applied to the received genotypes. The pairwise linkage disequilibrium between BsmI, ApaI, TaqI and Tru9I was confirmed (p<0,001). Allele frequencies did not differ between the groups. However, the haplotypes BsmI(G)#TaqI(C) and BsmI(A)#TaqI(T) were inversely associated with colorectal cancer incidence (p<0,001), the odds being 15,0 times smaller (odds ratio, 0,067; 95% confidence interval, 0,016-0,284) and 5,3 times smaller (odds ratio, 0,188; 95% confidence interval, 0,077-0,461), respectively, compared to non-carriers. Our findings suggest that the vitamin D receptor haplotypes BsmI(G)#TaqI(C) and BsmI(A)#TaqI(T) have a protective effect against colorectal cancer in Caucasians. This study was aimed to investigate whether variants of the vitamin D receptor poly(A) microsatellite are associated with colorectal cancer incidence. The poly(A) polymorphism was analyzed by a combination of GeneScan® and sequencing. There was a distinct separation between long and short alleles. We found 19, 20, 21 and 22 A-repeats for the long variant and 14 and 15 A-repeats for the short variant. Frequencies of long and short alleles did not differ between cases and controls, nor did frequencies of any single variant. The poly(A) microsatellite was in strong linkage disequilibrium with the nearby loci BsmI, Tru9I, ApaI and TaqI, but not with the more distant loci CDX-2 and FokI. The genotype pair poly(A)-TaqI and the complex genotype poly(A)-TaqI-BsmI were differently distributed between colorectal cancer patients and controls. Haplotype analysis of all poly(A )-TaqI-BsmI combinations revealed an underrepresentation of colorectal cancer patients among individuals with non linkage-conform alleles. The production of vitamin D (1α,25(OH)2D3, calcitriol) is affected by hydroxylases CYP24A1, CYP27A1 and CYP27B1. There is a coherence between Vitamin D, Vitamin D pathway and Vitamin D receptor and incidence and origin of colorectal cancer. Selected polymorphisms of CYP24A1, CYP27A1 and CYP27B1 gene were determined in a series of 928 caucasian subjects (healthy controls and colorectal cancer patients) from Germany using SNPlexTM technology and sequencing. SNP frequencies of the VDR gene polymorphisms for the minor alleles correspond to previous studies in Caucasian populations. Allele frequencies were without any characteristic variations regarding to the case-control-classification. No variant showed any significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium. Haplotype analysis and association tests between complexe genotypes and pairs of variants revealed no significant association with the incidence of colorectal cancer. We found a strong pairwise linkage disequilibrium between the CYP27B1 variants (p<0,001). The influence of sodium butyrate, all-trans retinoic acid and vitamin D on the expression of certain target genes in two colorectal cancer cell lines has been investigated. The human colorectal cancer cell lines Caco-2 and SW480 were induced with sodium butyrate, all-trans retinoic acid and vitamin D for different incubation times. After isolation of RNA, Real Time RT-PCRs was performed on vitamin D receptor and E-cadherin. Vitamin D receptor and E-cadherin were markedly increased after 6 h, 12 h and 24 h. Vitamin D as physiological inductor showed the strongest effects in the Caco-2 cell line model. A GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 microarray analysis was conducted to verify these results and to clarify the regulation of further candidate genes. Upregulated or downregulated expression (p<0,01, fold-change- value>1,5 respectively <0,67) was found for several genes of the xenobiotic metabolism e.g. SULT1C2, CYP3A5, CYP24A1, for calcium homeostasis, phosphate balance, glucose transport and for fatty acid and steroid metabolism e.g. HSPA9, PPARGC1B. In summary, within this study various variants of vitamin D-regulated genes have been associated with incidence of colorectal cancer and after vitamin D-treatment the expression for different target genes of the vitamin D-metabolism were found regulated by cell line models with RT-PCR and microarray analysis.