Lymphozytäre DNA-Schäden als diagnostische- und krankheitsaktivitäts-Biomarker bei Patienten mit früher Multipler Sklerose

Abstract

Hintergrund: In eukaryoten Zellen kommt es als Reaktion auf DNA- Doppelstrangbrüche zur Phosphorylierung des Histon Proteins H2AX in der Umgebung der DNA-Bruchstelle. Phosphoryliertes H2AX wird als γ-H2AX bezeichnet und lässt sich immunfluoreszenzmikroskopisch als intranukleärer Focus darstellen und quantifizieren. In ähnlicher Weise wird auch p53 bindendes Protein 1 (53BP1), welches einen Regulator der zellulären Antwort auf DNA Doppelstrangbrüche darstellt, zu DNA-Doppelstrangbrüchen rekrutiert. Die Expression von γ-H2AX in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurde unlängst als möglicher diagnostischer und Krankheitsaktivitäts-Biomarker bei schubförmig remittierender Multipler Sklerose (RRMS) vorgeschlagen. Ziel: Untersuchung der Bedeutung von γ-H2AX und 53BP1 Foci in PBMCs als diagnostische- und krankheitsaktivitäts-Biomarker bei Patienten mit klinisch isoliertem Syndrom (CIS) und früher RRMS. Methoden: Von 25 Patienten mit einem CIS oder früher RRMS und 27 gesunden Kontrollen wurden frische PBMCs aus Vollblut isoliert, immunzytochemisch für γ-H2AX und 53BP1 markiert und mittels automatisierter indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie hinsichtlich der γ-H2AX- und 53BP1-Expression ausgewertet. Alle Patienten erhielten eine 3 Tesla MRT Untersuchung und eine ausführliche klinische Untersuchung mit Erhebung des Expanded Disability Status Scale (EDSS) Scores. Weiterhin wurden zuvor gefrorene PBMCs von 10 Patienten mit und ohne kontrastmittelaufnehmenden Läsionen in der kraniellen MRT, sowie PBMCs von 10 gesunden Kontrollen hinsichtlich ihrer γ-H2AX und 53BP1 Expression verglichen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Mann-Whitney Tests für den Gruppenvergleich der γ-H2AX und 53BP1 Level, sowie mit Spearman Korrelationen für die Korrelation der γ-H2AX und 53BP1 Level mit dem EDSS und MRT-Parametern. Ergebnisse: Die γ-H2AX und 53BP1 Level frischer PBMCs waren insgesamt niedrig und vergleichbar mit zuvor veröffentlichten Werten bei gesunden Probanden. Der Median (Range) betrug bei allen Studienteilnehmern für γ-H2AX 0,04 (0-0,5) Foci/Zelle und für 53BP1 0,005 (0-0,2) Foci/Zelle. Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen der Patienten- und Kontrollgruppe. Es bestand für beide Parameter keine statistisch signifikante Korrelation mit Anzahl und Volumen T2-gewichteter Läsionen im MRT oder dem EDSS Score. In dem Gruppenvergleich zuvor gefrorener PBMCs von Patienten mit kontrastmittelaufnehmenden Läsionen zeigten sich gegenüber Patienten ohne kontrastmittelaufnehmende Läsionen erhöhte γ-H2AX Level. γ-H2AX Level beider Gruppen überlappten jedoch stark und es zeigte sich keine Korrelation der γ-H2AX Level mit Anzahl oder Volumen kontrastmittelaufnehmender Läsionen. Für 53BP1 bestand kein Gruppenunterschied. Fazit: Lymphozytäre γ-H2AX und 53BP1 Foci scheinen keinen geeigneten diagnostischen und/oder Krankheitsaktivitätsmarker bei Patienten mit früher MS darzustellen. Die hier erhobenen Daten sprechen nicht dafür, dass lymphozytäre DNA Doppelstrangbrüche eine wesentliche Rolle in der Pathogenese der MS spielen.

Background: In eukaryotic cells, DNA double-strand breaks lead to phosphorylation of the histone protein H2AX close to the break site. Phosphorylated H2AX is termed γ-H2AX and can be quantified via immunofluorescence microscopy as intranuclear foci. Likewise, p53-binding protein (53BP1), a regulator of the cellular response to DNA double-strand breaks, is recruited to sites of DNA double-strand breaks. γ-H2AX expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was recently proposed as a diagnostic and disease activity marker in patients with relapsing remitting multiple sclerosis (RRMS). Objective: To study the significance of γ-H2AX and 53BP1 foci in PBMCs as diagnostic and disease activity markers in patients with clinically isolated syndrome (CIS) and early RRMS. Methods: Freshly isolated PBMCs of patients with CIS/early RRMS (n = 25) and healthy controls (n = 27) were stained with specific antibodies for γ-H2AX and 53BP1. Nuclear γ-H2AX and 53BP1 expression was determined via fully automated indirect immunofluorescence microscopy. Patients underwent 3 Tesla MRI and clinical examination including expanded disability status scale (EDSS) score. Furthermore, γ-H2AX and 53BP1 were also compared in previously frozen PBMCs of each 10 CIS/early RRMS patients with and without contrast enhancing lesions and 10 healthy controls. Statistics were performed using Mann Whitney test for group comparisons and Spearman correlation for correlation of EDSS and MRI- parameters. Results: In fresh PBMCs, the γ-H2AX and 53BP1 levels were low and similar to previously reported values in healthy individuals. The median (range) across all study participants for γ-H2AX was 0.04 (0–0.5) foci/cell and for 53BP1 0.005 (0–0.2) foci/cell. For both parameters, there was no significant difference between patients and healthy controls. Both parameters neither correlated with the number nor volume of T2-weighted lesions on MRI, nor with the EDSS. γ-H2AX, but not 53BP1, levels were higher in previously frozen PBMCs of patients with than without contrast enhancing lesions but γ-H2AX values of both groups overlapped and γ-H2AX did not correlate with the number or volume of contrast enhancing lesions. Conclusion: Lymphocytic γ-H2AX and 53BP1 foci do not seem to be promising diagnostic and/or disease activity biomarkers in patients with early multiple sclerosis. Lymphocytic DNA double- strand breaks are unlikely to play a major role in the pathophysiology of multiple sclerosis.