Properties of gap junctional coupling among glial cells in the central nervous system

Abstract

Glial cells play an important role during development and are essential for proper function of the central nervous system (CNS) and aberrant glial function has been described in all CNS pathologies. Astrocytes and oligodendrocytes are coupled via gap junctions (GJ), which allow exchange of ions, signalling molecules, metabolites, and form panglial networks of various size and composition in the different brain areas. NG2 cells, a type of glial precursors, can also participate in these networks. However, not much is yet known about whether microglia, the immune cells of the brain, participate in GJ coupling. GJs are formed by connexins (Cx). Astrocytes express Cx30 and Cx43 and oligodendrocytes express Cx32 and Cx47. Whether or not microglia express any Cxs is still controversial. In my doctoral thesis I studied glial gap junctional communication among astro-cytes, oligodendrocytes and NG2 cells in different brain areas. I characterized oli-godendrocytic electrical coupling and investigated whether panglial networks in the corpus callosum are used for glucose transport to axons. I furthermore asked if microglial cells form functional GJs in physiology and pathology, and characterized their electrophysiological properties change in pathology. To study these questions, I used the whole-cell patch-clamp technique combined with dye-filling to trace the glial networks in murine acute brain slices, followed by immunostaining for cell-type specific markers, allowing the characterization of the panglial network. Identification of cell types during experiments was achieved by using transgenic mouse models with fluorescently labeled glia. Electrical coupling of glial cell pairs and biophysical properties were characterized by paired recordings. My results show that astrocytes and oligodendrocytes form panglial networks in both the neocortex and in the corpus callosum, while the networks in the neocor-tex are larger and NG2 cells only participate in the networks in the corpus callo-sum. Furthermore, I found an intermediate astrocyte cell-type that expressed both Cx43 and Olig2, which was present in the neocortex, but not in the corpus callo-sum. Astrocytes act as energy storage elements and supply neurons with glucose via GJ. By dialysing glial cells with the glucose derivative 2NBDG, I studied their met-abolic coupling. Astrocytes in the corpus callosum were metabolically coupled to oligodendrocytes. When injected into oligodendrocytes, 2NBDG spread into adja-cent astrocytes and into the processes oriented along the myelinated axons, sug-gesting that this pathway may serve as a route for energy supply to axons. Oligodendrocytes in the corpus callosum are not only dye- and metabolically cou-pled to astrocytes, but are also electrically coupled to one another, which is essential for a stable intracellular and extracellular ionic homeostasis. Using paired recordings, I found that coupled oligodendrocytes have a linear, voltage independent, junctional conductance which could not be influenced by the GJ modulator kainate. Microglial cells, the resident immune cells of the CNS, respond to brain pathology with rapid phenotypical and functional changes, accompanied by alteration of their membrane current pattern. I studied coupling and membrane currents in glioma-associated microglia and macrophages/monocytes as well as stroke-associated microglia/macrophages in the MCAo model and compared these to control and stab wound-associated microglia. The current profile of microglia showed inward rectifying currents reminiscent of an intermediate activation state when compared to other disease models or cell culture. Glioma- and stroke-associated macrophages/monocytes showed a higher specific outward conductance and a significantly lower capacitance indicative of a smaller membrane area than microglia. In none of the models studied, dye-coupling of microglia/macrophages via GJs was observed. Consistently with these observations, no Cx43 expression was found when performing qRT-PCRs in freshly isolated microglia and macrophages. Proper GJ coupling is a prerequisite for normal brain function. In this work, I pro- vide new evidence that GJ coupling among glial cells in different areas of the CNS is highly heterogenous in regard of function, cell types participating, and size of the networks.

Glia-Zellen spielen nicht nur eine wichtige Rolle während der Entwicklung sondern auch für viele essentielle Funktionen des Zentralen Nervensystems (ZNS). Fehlfunktionen der verschiedenen Glia-Zelltypen spielen bei verschiedenen Pathologien des ZNS eine wichtige Rolle. Astrozyten und Oligodendrozyten sind über Gap Junction (GJ) Proteine miteinander verbunden. Diese GJs ermöglichen den Austausch von Ionen, Signalmolekülen, Metaboliten und formen pangliale Netzwerke, welche sich in ihrer Größe und Zusammensetzung in verschiedenen Gehirnarealen unterscheiden können. NG2-Zellen, eine Art Glia-Vorläuferzelle, können auch Teil dieser panglialen Netzwerke sein. Hingegen weiß man bisher nicht, ob Mikrogliazellen - die Immunzellen des Gehirns - an der GJ Kopplung beteiligt sind. Auf molekularer Ebene setzen sich GJs aus Connexin (Cx)-Untereinheiten zusammen. Astrozyten exprimieren Cx30 und Cx43 und Oligodendrozyten Cx32 und Cx47. Die Expression von Connexinen und Formierung von GJs in Mikrogliazellen ist hingegen noch umstritten. In meiner Doktorarbeit habe ich die gliale GJ-Kommunikation zwischen Astrozyten, Oligodendrozyten und NG2-Zellen in verschiedenen Gehirnarealen untersucht. Desweiteren habe ich die elektrische Kopplung zwischen Oligodendrozyten charakterisiert und untersucht, ob sich das murine Gehirn die panglialen Netwerke für den Glukose-Transport zu den Axonen im Corpus Callosum zu Nutze macht. Darüber hinaus stellte ich die Frage, ob Mikrogliazellen unter normalen physiologischen oder pathologischen Bedingungen funktionelle GJs bilden, und wie sich die elektrophysiologischen Eigenschaften der Mikrogliazellen unter diesen Bedingungen verändern. Hierfür verwendete ich Ganzzell-Patch-Clamp Technik an Gliazellen in akut isolierten Gehirnschnitten der Maus. Mit Hilfe dieser Methode wurde über die Patch-Pipette eine Glia-Zelle mit einem GJ- Tracer injiziert, welcher bei GJ-gekoppelten Zellen in benachbarte Zellen diffundierte. Im Anschluss wurden diese Hirnschnitte fixiert und mit zelltypspezifischen Markern immunohistologisch gefärbt, was eine Auswertung der einzelnen Zellen im panglialen Netzwerk ermöglichte. Durch die Verwendung von transgenen Mausmodellen mit fluoreszenzmarkierten Glia-Zellen konnte ich die initial gefüllte Zelle identifzieren. Die elektrische Kopplung von Glia- Zellpaaren und deren biophysikalischen Eigenschaften wurden mittels Paar- Aufnahmen/Pair recordings charakterisiert. Meine Ergebnisse zeigen, dass Astrozyten und Oligodendrozyten pangliale Netz-werke im Neocortex als auch im Corpus callosum ausbilden, die Netzwerke im Neocortex größer sind als im Corpus callosum und NG2-Zellen nur in den Netz-werken des Corpus callosum vorkommen. Zusätzlich habe ich eine intermediäre Astrozyten-Zellart im Neocortex, jedoch nicht im Corpus Callosum charakterisieren können, welche sowohl Cx43 als auch Olig2 exprimiert. Astrozyten wirken als Energiespeicher und versorgen Neurone mit Metaboliten, wobei sie den Transport von Glukose über GJ-Netzwerke nutzen, wie z.B. im Hippocampus gezeigt. Hier untersuchte ich die metabolische Kopplung zwischen Glia-Zellen im Corpus Callosum mit Hilfe eines grün-fluoreszenten Glucosederivats 2NBDG und der Ganzzell-Patch- Clamp Technik. Die Experimente zeigten, dass Astrozyten im Corpus Callosum metabolisch zu Oligodendrozyten gekoppelt sind, als auch umgekehrt. Die Injektion von Oligodendrozyten zeigte eine zusätzlich Verteilung des Glucosederivats in anliegende Fortsätze, entlang der markhaltigen Axone, was eine direkte axonale Energieversorung durch die Oligodendrozyten suggeriert. Oligodendrozyten im Corpus Callosum sind nicht nur Farbstoff- und metabolisch gekoppelt zu Astrozyten, sondern auch elektrisch. Die elektrische Kopplung ist essentiell für ein stabiles intrazelluläres als auch extrazelluläres Ionen- Gleichgewicht. Die Paar-Aufnahmen von Oligodendrozyten haben gezeigt, dass die junctionale Leitfähigkeit linear und spannungsunabhängig ist. Ferner zeigt die Verabreichung des GJ-Modulator Kainate keinen Einfluss auf diese Leitfähigkeit. Mikrogliazellen, die Immunzellen des ZNSs, reagieren umgehend auf Pathologien mit phänotypischen und funktionellen Veränderungen als auch mit Veränderung ihrer Membranstromprofile. Hier wurden die GJ-Kopplung und die Membranströme von Mikrogliazellen und invadierenden Makrophagen/Monocyten im Glioma- und Schlaganfall/Ischämie-Modell untersucht und mit Kontroll- Mikrogliazellen und stichwunden-assoziierten Mikrogliazellen verglichen. Das Stromprofil von Mikrogliazellen zeigte einwärts-gleichgerichtete Ströme, was auf einen intermediären Aktivierungszustand, im Vergleich zu anderen Pathologien oder Zellkulturen hinweist. Glioma- und Schlaganfall-assoziierte Makrophagen/Monozyten besitzen eine höhere, nach außen gerichtete, spezifische Leitfähigkeit und eine deutlich geringere Kapazität als Mikrogliazellen, bezeichnend für eine kleinere Membranoberfläche. In keinem der untersuchten Modelle war eine Farbstoffkopplung von Mikroglia/ Makrophagen durch GJs nachweisbar. Diese Beobachtungen wurden zusätzlich gestützt durch die fehlende Cx43-Expression, in frisch isolierten Mikroglia und Makrophagen in qRT-PCR Untersuchungen. Die ordnungsgemäße GJ-Kopplung ist eine Voraussetzung für normale Gehirn-funktionen. Die Ergebnisse meiner Arbeit liefern neue Erkenntnisse, dass die GJ-Kopplung zwischen Glia-Zellen in verschiedenen Hirnarealen des ZNSs hinsichtlich der Funktionen der beteiligten Glia- Zellarten als auch der Größe der Netzwerke eine große Heterogenität aufweisen.