Einfluss einer transgenen Überexpression von humanem Endothelin-2 (h-endoET-2) auf die diabetische Nephropathie der Ratte

Abstract

Fragestellung: Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselkrankheit mit weltweit zunehmender Prävalenz. In Deutschland sind ca. 7–8 % der Erwachsenenbevölkerung betroffen, ca. ein Drittel entwickeln renale Manifestationen im Sinne einer diabetischen Nephropathie. Die bisherigen Ergebnisse zur pathophysiologischen Bedeutung des Endothelin-Systems für die diabetische Nephropathie sind inkonsistent, teilweise sogar widersprüchlich. In dieser Promotionsarbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass eine verstärkte renale Endothelin-Expression den Ausprägungsgrad von diabetischer Nephropathie verstärkt. Methoden: Um die Hypothese zu prüfen, wurde in einem Rattenmodell mit transgener Überexpression von humanem Endothelin-2 (h-endoET-2) eine diabetische Stoffwechsellage mittels Streptozotozin- Injektion induziert und der Verlauf über insgesamt 6 Monate beobachtet. Als Kontrolle bzw. Vergleichspunkt dienten nichtdiabetische transgene Geschwistertiere und nichttransgene Tiere mit und ohne Diabetesinduktion (insgesamt 4 Versuchsgruppen). Alle 4 Wochen wurden Blutzucker, Plasmakreatinin, Plasmaharnstoff, 24 h-Albuminurie und 24 h-Proteinurie sowie Kreatinin- und Harnstoffclearances berechnet bzw. gemessen. Nach 6 Monaten Versuchsdauer wurde der systolische Blutdruck gemessen, die Tiere getötet und die Nierengewichte bestimmt. Im Plasma und in glomerulären Kulturüberständen wurden die Endothelin-Konzentrationen per ELISA gemessen. Mittels Computer- gestützter Histomorphometrie wurde das glomeruläre Volumen und der Glomerulosklerosegrad erfasst. Aus den Nieren wurden die Glomeruli isoliert und glomeruläre mRNA-Expression von ET-1, ET-2, ET-Rezeptoren (A/B), Fibronektin, TGF-ß und PAI-1 (quantitative PCR) und Proteinexpression von Fibronektin, TGF-ß und PAI-1 (ELISA) bestimmt. Ergebnisse: Die Zuordnung der Versuchstiere zu den 4 Gruppen entsprechend diabetisch/ nichtdiabetisch und transgen/ nichttransgen wurde durch Blutzuckerbestimmungen und renalen DNS- Nachweis von humanem Endothelin-2 bestätigt. Bei transgenen ET-2-Tieren dokumentierten erhöhte ET-Konzentrationen im Plasma und den glomerulären Kulturüberständen die aktive Synthese des Transgens. Die Hyperglykämie führte zu einer weiteren Erhöhung der ET-Plasmaspiegel ohne die glomeruläre ET- Produktion weiter zu verändern. Im Versuchsverlauf starben 12% der diabetischen Wildtyp-Tiere und 55% der diabetischen ET-2-transgenen Tiere, ohne das dieses auf eine renale Funktionseinschränkung zurückführbar war. Der systolische Blutdruck war in allen Gruppen vergleichbar und nicht signifikant unterschiedlich. In den Wildtyp-Tieren führte die diabetische Stoffwechsellage zu signifikanten Anstiegen von Proteinurie, Albuminurie, Nierengewicht und glomerulärem Volumen, glomerulärer Matrixakkumulation und Fibronektinexpression sowie erhöhter Harnstoffclearance als Zeichen der diabetischen Nephropathie. In den nicht-diabetischen ET-2-transgenen Tieren fanden sich signifikante Anstiege von Proteinurie und Albuminurie sowie leicht verstärkter glomerulärer Hypertrophie und Sklerose. In den diabetischen ET-2-transgenen Tieren fanden sich signifikante Erhöhungen von Albuminurie, Nierengewicht, glomerulärer Hypertrophie und Sklerose sowie der Harnstoff- Clearance, jedoch ohne, dass diese in ihren Relationen über die Veränderungen bei den diabetischen Wildtyp-Tieren hinausgingen. Die endogene Ratten-ET-1 -mRNA-Expression war bei den ET-2-transgenen nichtdiabetischen Tieren signifikant erhöht. Signifikante Veränderungen der ET-Rezeptor-mRNA in Gegenwart von Hyperglykämie und/oder ET-2-Überexpression wurden nicht beobachtet. Schlussfolgerungen: Die Kombination von transgener Endothelin-2-Überexpression und Hyperglykämie führt in diesem Tiermodell zu keiner verstärkten Ausprägung von diabetischer Nephropathie bei der Ratte. Unsere Ausgangshypothese konnte somit nicht bestätigt werden. Der gewählte Versuchsansatz gibt neue Einblicke in die Rolle von Endothelin in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie. Man kann spekulieren, dass hier das Endothelinsystem im Vergleich zum Renin-Angiotensin-System eine weniger bedeutsame Funktion einnimmt. Die Ergebnisse sind im Einklang mit Untersuchungen, die darauf hinweisen, dass die selektive ETA-Rezeptorblockade einer gemischten Endothelin-Rezeptorhemmung überlegen ist.

Introduction: Diabetes mellitus is an abundant metabolic disorder with a merging prevalence worldwide. In Germany 8% of the adult population is affected. Of those one third suffer from diabetic nephropathy with renal impairment. As an index factor the significance of the endothelin regulation for the development and the degree of diabetic nephropathy remains unclear and requires further evaluation. In our study we analysed endothelin (mRNA-)expression and the associated magnitude of diabetic nephropathy. Material and Methods: For experimental analysis a transgenic rat model with overexpression of human endothelin-2 (huET-2+) was applied and a diabetic metabolism induced by streptocotocin injection. As controls a group of transgenic non diabetic and 2 non transgenic either diabetic non diabetic were assembled The groups were followed for 6 months. On a four weekly interval plasma levels of glucose, creatinin, urea, 24h proteinuria and albuminuria were measured. Furthermore urea and creatinin clearences were calculated. As the determination procedure at the end of the 6 month interval systolic blood pressure was measured, the kidneys resected and weight. The endothelin concentration in plasma and glomerular supernatants were analysed with ELISA. Computer assisted histomorphometrics was applied for estimating glomerular volume and degree of glomerular sclerosis. Finally from the rat kidneys the glomerula were isolated and mRNA-expression of ET-1, ET-2, ET-receptors (A/B), Fibronektin, TGF-ß and PAI-1 were obtained. Protein expression of Fibronektin, TGF-ß und PAI-1 (ELISA) was analysed. Results: In a 4 group rat model study diabetic and non diabetic as well as transgenic and non transgenic characteristics due to present hyperglykemia and increased human endothelin-2 expression were observed. For both transgenic groups ET levels in plasma and glomerular supernatants were elevated. With induced diabetic metabolism a relevant increase of ET plasma levels were found however quantity of ET levels of glomerular supernatants were not affected. During the study 12% of the diabetic wild type rats and 55% diabetic transgenic rats perished non related to renal impairment. The systolic blood pressure was comparable among the four study groups. In wild type rats with induced diabetic metabolism proteinuria, albuminuria, renal weight, glomerular volume and matrix-accumulation, fibronectin expression and urea clearance increased significantly with associated diabetic nephropathy. In transgenic non diabetic rats a significant rise of proteinuria, albuminuria and degree of glomerular hypertrophy and sclerosis was found. In transgenic diabetic rats a significant rise of proteinuria, albuminuria and degree of glomerular hypertrophy and sclerosis was observed. Changes however were comparable in magnitude with those present in the wild type diabetic group. The animals endogenous ET-1 m-RNA expression was significantly elevated in transgenic nondiabetic rats Significant changes of ET-receptor-mRNA in the presence of hyperglycemia and/or ET2 overexpression was not observed. Conclusion: The combination of transgenic endothelin 2 overexpression and induced hyperglycemia in the applied rat model results in no increase of manifest diabetic nephropathie. Our initial hypothesis failed. Although new aspects of the role of endothelin in the pathogenesis of diabetic nephropathy were discovered. We may conclude the impact of the endothelin regulation system is less important for the development of the diabetic nephropathy than i.e. the renin-angiotensin system.