Stationäre und mobile Verfahren zur Detektion und Differenzierung biologischer Toxine

Abstract

Biologische Toxine sind aufgrund ihrer Toxizität und ihres Vorkommens von hoher Relevanz im Gesundheits-, Lebensmittel- und Sicherheitsbereich. Akzidentelle und intentionale Intoxikationen haben das Potential, schwerwiegende Krankheitsbilder zu induzieren, welche letal verlaufen können. Ein schneller, sensitiver und spezifischer Nachweis der auslösenden Proteine ist entscheidend, um adäquate Schutzmaßnahmen und Behandlungsoptionen zu ergreifen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stationären und mobilen immunologischen Nachweissystemen für Staphylokokken Enterotoxin A (SEA), Abrin und die Botulinum Neurotoxine BoNT/A, /C, /CD, /D, /DC und /E. Technisch herausfordernd ist das sichere Erfassen von Toxinen, die in komplexen Gruppen nahverwandter, funktionell ähnlicher Moleküle vorkommen und – je nach Fragestellung – differenziert werden müssen. Im Rahmen der Arbeit wurden, basierend auf 10 Hybridoma-Fusionen, insgesamt 25 monoklonale Antikörper (mAk), die die genannten Toxine spezifisch und hoch-affin binden, isoliert und umfassend charakterisiert. Die neuen Reagenzien wurden verwendet, um stationäre (laborbasierte) und mobile (vor Ort) Detektionsverfahren zu etablieren. Für die humanpathogenen BoNT/A und /E gelang beispielsweise die Entwicklung von Sandwich ELISAs, welche alle in der Gruppe vorhandenen Subtypen nachweisen. Ausgewählte mAk waren in der Lage, BoNT/A sowie ein kürzlich neu identifiziertes Mosaiktoxin BoNT/H in vitro zu neutralisieren. Mit Hilfe der anti-Abrin mAk gelang die Differenzierung zwischen Abrin-a und dem nahverwandten, aber deutlich weniger toxischen Abrus Agglutinin. Alle etablierten Toxin-spezifischen Sandwich ELISAs erwiesen sich als äußerst sensitiv mit Nachweisgrenzen zwischen 2 und 30 pg/ml Toxin, was mehrere Größenordnungen unterhalb der halbletalen Dosen für Menschen liegt. Durch die neu generierten Antikörper gegen veterinärpathogene BoNT (Serotypen C, D und ihre Mosaikvarianten CD und DC) gelang erstmalig eine eindeutige Differenzierung der Toxine auf Basis von vier Sandwich ELISAs. Die Ergebnisse konnten auf funktioneller Ebene bestätigt werden, indem die Mosaiktoxine einer Kombination aus Immunoaffinitätsanreicherung, enzymatischem Aktivitätstest und massenspektrometrischer Analyse unterzogen wurden. Eine umfassende Validierung der vier differenzierenden ELISAs im Vergleich zu funktionellen (Endopep-MS Assay) und genetischen Methoden (PCR) bei Testung von mehr als 90 Clostridien- Stämmen und veterinärpathogenen Realproben ergab eine 100%-ige Überein- stimmung der Ergebnisse. Zur Etablierung eines schnellen und einfachen Multiplex-Detektionssystems, das von Einsatzkräften vor Ort eingesetzt werden kann, wurden die Antikörper gegen SEA, BoNT/C, /D, /E und Abrin in die vollautomatisierte Detektionsplattform pTD, einem elektrischen Biochipsystem, implementiert. Die fünf Toxine konnten simultan oder einzeln innerhalb von 20 min Messzeit mit ausreichender Sensitivität und einem Detektionslimit zwischen 0,5 und 17,5 ng/ml detektiert werden. Das pTD System erfasste die Toxine in ausgewählten dotierten Umwelt- oder Lebensmittelproben ohne Kreuzreaktivitäten. In einer Anwenderübung wurde die pTD Plattform erfolgreich durch Einsatzkräfte von Polizei und Feuerwehr auf Praxistauglichkeit geprüft. Auf Basis der erhaltenen Ergebnisse soll der hier entwickelte Biochip zur Detektion von SEA, BoNT/C, /D, /E und Abrin in Kürze durch den industriellen Kooperationspartner kommerzialisiert werden. Insgesamt wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit qualitativ hochwertige mAk zum Nachweis von SEA, Abrin, BoNT/A, /C, /CD, /D, /DC und /E etabliert und umfassend charakterisiert, mit denen bestehende Fähigkeitslücken im Bereich stationärer und mobiler Detektionssysteme geschlossen wurden.

Biological toxins are relevant in the security sector as well as in the health and food sector due to their toxicity and availability. Inadvertent and intended intoxications potentially induce severe and possibly fatal diseases. Therefore, a rapid, sensitive, and specific detection of toxins is highly important in order to take adequate countermeasures. The aim of this thesis was to develop stationary and mobile detection methods for staphylococcal enterotoxin A (SEA), abrin, and the botulinum neurotoxins BoNT/A, /C, /CD, /DC, and /E. The fact that toxins occur in groups of highly related and functionally similar variants is technically challenging since all variants have to be detected and, if necessary, differentiated. Based on 10 hybridoma fusions, a total number of 25 monoclonal antibodies (mAb) with high specificity and affinity were isolated and thoroughly characterized. Stationary (lab-based) and mobile (on site) detection methods were established using the newly generated antibodies. For example, sandwich ELISAs developed for the detection of serotypes BoNT/A and /E pathogenic to humans were able to detect all available subtypes. Furthermore, several mAbs showed in vitro neutralization of BoNT/A and of the recently identified mosaic toxin BoNT/H. Moreover, anti-abrin mAbs enabled the differentiation of abrin and the closely related, but less toxic Abrus agglutinin. In sum, all established sandwich ELISAs were highly specific and sensitive with detection limits between 2 and 30 pg/mL toxin, which corresponds to several magnitudes below half-lethal doses in humans. For the first time, veterinary BoNT serotypes C, D and their mosaic toxins CD and DC were unambiguously differentiated by four distinct sandwich ELISAs based on highly specific mAbs. Additionally, results were verified on a functional level by a combination of immunoenrichment, enzymatic cleavage assays, and mass spectrometry analysis. The ELISAs were extensively validated and results showed 100% concordance with data obtained by functional (Endopep-MS assay) and genetic methods (PCR) using a panel of more than 90 Clostridium strains and real sample material from veterinary botulism outbreaks. In order to establish a fast and reliable mobile detection system, which can be used by first responders, antibodies against SEA, abrin, BoNT/C, /D, and /E were implemented in the fully automated on-site detection platform pTD. With this electrical biochip system, the five toxins could be detected either separately or simultaneously within 20 min with detection limits ranging between 0.5 and 17.5 ng/mL. Closely related toxins showed no cross- reactivity. The system was suitable for detection of the mentioned toxins from selected environmental samples and beverages. The usability of pTD was successfully demonstrated in a training scenario by first responders from police and fire brigades. Based on these results, the newly established biochip for the detection of SEA, BoNT/C, /D, /E and abrin will subsequently be commercialized by the industrial cooperation partner. To conclude, dedicated monoclonal antibodies for the detection of SEA, abrin and the botulinum neurotoxins BoNT/A, /C, /CD, /DC, and /E were established and thoroughly characterized in this work in order to significantly improve stationary and mobile detection methods.