Component-resolved diagnostics of food-allergy

Abstract

Food allergy is a severe disease with increasing prevalence. Until now, no single laboratory parameter was identified that could prove the diagnosis of food allergy nor predict its course. This may be due to insufficient test systems with natural extracts. Component-resolved diagnostics tests for single allergenic components and tries to relate them to the disease. Recombinant proteins have become alternatives to native components which may be impure. On the other hand, recombinant proteins may be misfolded and lack functionality. Therefore, both need to be compared in parallel. In pediatric populations, where patient material is limited, the application of microarrayed disgnostics is the matter of choice. The most common microarray, the ImmunoCAP ISAC, provides several food allergens that can be tested for. On the other hand, this microarray is only semiquantitative, lacks sensitivity as well as reproducibility, and only detects one class of immunoglobulins. In this study, an alternative to ISAC was used, the copoly(DMA-NAS-MAPS) silicon chip which was reported to be more sensitive and robust. The performance of this microarray was assessed by assaying a large number of well-described sera to native and recombinant components of cow’s milk and hen’s egg. IgE and IgG 4 , which may be involved in tolerance development, were detected in parallel from one drop of blood. The silicon microarray was sensitive and showed a broad working range for hen’s egg comparable to ImmunoCAP. For cow’s milk it was less sensitive, and the working range for IgG 4 may be limited at higher concentrations. In the lower range, its intra and inter assay variance was better compared to ISAC. Native components were found to correlate better with quantitative and semiquantitative results than recombinant variants. The exact reason for this result could not be determined. However, the silicon microarray is a semiquantitative assay and a good alternative to ISAC. Another important disease in childhood is food allergy to ingested wheat. The diagnosis of wheat allergy is still difficult, because wheat-specific IgE, determined in blood, does not correlate well with clinical symptoms. Component-resolved diagnostics by means of qualitative immunoblots was applied to compare wheat allergic and tolerant individuals in their IgE-recognition pattern to water and salt soluble proteins and to water-insoluble proteins which may be underrepresented in commercial test systems. A broad spectrum of protein bands in both protein fractions was detected, and some were identified, but no differences in the pattern between WA and WT individuals was found. The significance of ω5-gliadin, which is reported to be a specific marker of wheat allergy, could not be confirmed. The benefit of component- resolved diagnostics in the workup of wheat allergy is therefore questionable.

Die Nahrungsmittelallergie ist eine ernsthafte Erkrankung mit zunehmender Prävalenz. Bis dato wurde kein einzelner Laborparameter identifiziert, der die Diagnose belegen und den Verlauf vorhersagen könnte. Ein Grund dafür könnten unzulängliche Testsysteme mit natürlichen Extrakten sein. Komponenten-basierte Diagnostik testet auf einzelne allergene Bestandteile (Komponenten) und versucht, diese mit der Erkrankung in Beziehung zu setzen. Rekombinante Proteine sind dabei Alternativen im Vergleich zu nativen Proteinen, die verunreinigt sein können. Auf der anderen Seite können rekombinante Proteine fehlgefaltet und somit funktionslos sein. Daher müssen beide parallel verglichen werden. In pädiatrischen Populationen ist Patientenmaterial begrenzt und die Anwendung von miniaturisierter Diagnostik auf Microarrays die Methode der Wahl. Am weitesten verbreitet ist der ImmunoCAP ISAC, der mehrere Nahrungsmittelallergene zur Testung bereitstellt. Andererseits ist dieser Microarray nur semiquantitativ, es fehlt ihm an Sensitivität und Reproduzierbarkeit und er detektiert nur je eine Klasse von Immunglobulinen. In dieser Arbeit wurde daher alternativ der copoly(DMA-NAS-MAPS) Siliziumchip verwendet, der zuvor als robuster und sensitiver beschrieben wurde. Die Leistungsfähigkeit dieses Microarrays wurde ermittelt, indem eine Vielzahl gut beschriebener Seren an nativen und rekombinanten Komponenten aus Kuhmilch und Hühnerei erprobt wurden. IgE und IgG 4, welches in der Toleranzentwicklung involviert sein könnte, wurden parallel in einem Tropfen Blutflüssigkeit bestimmt. Der Silizium-Microarray war sensitiv und zeigte einen breiten Arbeitsbereich für Hühnerei vergleichbar mit dem ImmunoCAP, der quantitativen Routineplatform. Für Kuhmilch war er weniger sensitiv. Der Arbeitsbereich für IgG 4 dürfte bei höheren Konzentrationen begrenzt sein. Im unteren Bereich waren intra- und inter-Assay-Varianz besser als beim ImmunoCAP ISAC. Native Komponenten korrelierten besser mit quantitativen und semiquantitativen Ergebnissen als die rekombinanten Varianten. Der genaue Grund für diesen Befund konnte nicht bestimmt werden. Nichtsdestotrotz ist der Silizium- Microarray ein semiquantitativer Assay und eine gute Alternative zum ISAC. Eine andere wichtige Nahrungsmittelallergie im Kindesalter ist die gegen Weizen. Die Diagnose Weizenallergie ist immer noch schwierig zu stellen, da das im Blut bestimmte Weizen-spezifische IgE nicht gut mit der klinischen Symptomatik korreliert. Komponenten-basierte Diagnostik auf Basis von qualitativen Immunoblots wurde angewendet, um Weizen-allergische und Weizen- tolerante Patienten in ihren IgE-Erkennungsmustern auf wasser- und salzlösliche sowie wasser-unlösliche Proteine zu vergleichen, zudem letztere in kommerziellen Testsystemen unterrepräsentiert sein könnten. Es wurde ein breites Spektrum an Proteinbanden in beiden Fraktionen ermittelt. Einige Proteine wurden identifiziert, jedoch wurden keine Unterschiede im Erkennungsmuster zwischen Weizen-allergischen und Weizen-toleranten Patienten gefunden. Die Bedeutung von ω5-gliadin, das ein spezifischer Marker der Weizenallergie sein soll, konnte nicht bestätigt werden. Der Nutzen Komponenten-basierter Diagnostik in der Abklärung der Weizenallergie ist somit fraglich.