Structural, biochemical and functional analysis of glutamate receptors and the auxiliary protein stargazin

Abstract

Neurons communicate with each other at synapses. Neurotransmitters released from presynaptic terminals act as activators of ligand-gated ion channels at the postsynapse across the synaptic cleft and induce changes in membrane potential or activate signaling cascades. At the postsynaptic density, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxalzolepropionic acid (AMPA) receptors are the key mediators of fast excitatory neurotransmission in the brain through formation of excitatory postsynaptic currents (EPSCs), thus helping to propagate the electrical signal from one neuron to another. AMPARs furthermore promote formation and maturation of synapses during the early phases of synaptogenesis. The number and activity of AMPARs at the postsynapse is regulated through interaction with transmembrane AMPA receptor regulatory proteins (TARPs). The function of stargazin/type I TARPs on AMPAR trafficking itself is regulated upon TARP phosphorylation. One aim of this thesis was to understand how fast receptor activation is achieved. We aimed to understand how ligand binding to the four ligand-binding domains of the receptor mediates opening of the ion channel, as structural information of an active AMPAR tetramer is limited. Recent full-length cryo-EM and crystal structures tried to capture the receptor in an active state, however the ion channel was either not resolved or closed. Furthermore, we also aimed to understand the cellular mechanism for regulation of AMPAR function at the synapse. AMPARs associate with TARPs at the synapse, where TARPs mediate AMPAR gating, trafficking and pharmacology. It has been shown that the 120 residue long C-terminal domain of stargazin regulates AMPAR clustering at the postsynapse in a phosphorylation- dependent manner. Nine Ser residues within the C-terminal domain of stargazin have been shown to be phosphorylated, and their phosphorylation abolishes binding of stargazin to the negatively charged bilayer mediated by a positive Arg stretch. Using biochemical, biophysical and high-resolution and real-time structural studies we aimed to gain atomic insights into stargazin phosphorylation and evaluate the dependence of the lipid interaction on phosphorylation. By recombinantly expressing, purifying and crystallizing the isolated domain that is responsible for binding of the neurotransmitter, the isolated ligand-binding domain (sLBD), a high-resolution crystal structure of fully glutamate-bound sLBD in two different tetrameric arrangements, formed via crystal symmetry, could be obtained for the first time. We carefully analyzed the tetrameric LBD assemblies structurally, biophysically and functionally through electrophysiological recordings and computational modeling. Metal bridges at the interface between the LBD dimers and state- dependent cross-linking using zinc identified the more compact of the two LBD arrangements as being populated by full-length receptors during gating in either a fully or partially active AMPA receptor. I was furthermore also able to obtain zinc-dependent oligomers in solution as determined by static laser scattering. This study thus provides insights into the complex movements and conformational rearrangements of the LBD as a tetramer upon receptor activation. In order to investigate the importance of stargazin phosphorylation, I recombinantly expressed and purified the complete 120 residues long intracellular and unfolded C-terminal tail of stargazin. Differently tagged protein variants were expressed and purification was optimized, so that I was able to generate the complete and untagged stargazin C-terminal tail for the first time using it for biochemical, biophysical and structural characterization. In doing so, I could show that the C-terminal tail of stargazin electrostatically binds to negatively charged liposomes. Using mass spectrometric and NMR-spectroscopic analyses I found that stargazin C-terminal tail quantitatively gets phosphorylated by Ca2+/calmodulin- dependent kinase (CaMKII) and that phosphorylation abolishes binding to the lipid bilayer with one phosphorylated Ser residue being sufficient to reduce the ability of stargazin C-terminal tail to bind to liposomes by 50%. These results suggest that stargazin as a type I TARP could provide a molecular rheostat allowing for graded changes in synaptic strength.

Die Kommunikation zwischen Neuronen erfolgt an Synapsen. Neurotransmitter die an presynaptischen Terminalen freigesetzt werden, agieren als Aktivatoren von liganden-gesteuerten Ionenkanälen an der postsynaptischen Membran über den synaptischen Spalt hinaus und induzieren eine Änderung des Membranpotentials oder aktivieren Signalkaskaden. Α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxalzolpropansäure (AMPA) Rezep-toren sind die Hauptvermittler der schnellen exzitatorischen Neurotransmission im Gehirn, verursacht durch die Bildung von exzitatorischen postsynaptischen Strömen (EPSCs) und helfen somit, das elektrische Signal von einem bis zum nächsten Neuron weiterzuleiten. AMPARs sind weiterhin für die Bildung und den Ausbau von Synapsen in den frühen Phasen der Synaptogenese verantwortlich. Die Anzahl und Aktivität von AMPA Rezeptoren an der Postsynapse wird durch ihre Interaktion mit transmembranen AMPA Rezeptor regulatorischen Proteinen (TARPs) reguliert. Die modulatorischen Eigenschaften von Typ I TARPs/Stargazin auf den synaptischen AMPAR Transport wiederum werden durch Phosphorylierung reguliert. Eine der Zielsetzungen dieser Dissertation war es zu verstehen, wie die schnelle Aktivierung des Rezeptors realisiert werden kann und zu verstehen, wie die Liganden-Bindung an die vier Ligandenbindungsdomänen (LBDs) des Rezeptors zu einer Öffnung des Ionenkanals führt, da strukturelle Informationen über einen aktiven Rezeptor begrenzt sind. Aktuelle cryo-EM und Kristallstrukturen, mit dem Ziel, den Rezeptor in einem aktiven Zustand darzustellen, hatten entweder keinen aufgelösten Ionenkanal oder die Pore war verschlossen. Eine weitere Zielstellung war es, den zellulären Mechanismus zu verstehen, der die Funktion von AMPA Rezeptoren an der Synapse reguliert. AMPAR assoziieren mit TARPs an der Synapse, wo TARPs Aspekte der AMPAR Aktivierung, seines Transportes und seiner Pharmakologie regulieren. Es konnte gezeigt werden, dass der 120 Reste lange C-Terminus von Stargazin die Anhäufung von AMPA Rezeptoren an der Postsynapse in einer phopshorylierungs- abhängigen Weise reguliert. Es wurde gezeigt, dass neun Serin-Reste innerhalb der C-terminalen Domäne von Stargazin phosphoryliert werden und dass die Phosphorylierung die Bindung der Stargazin C-terminalen Domäne an die negative geladene Lipid-Doppelmembran verhindert, welche durch einen Abschnitt positiv geladener Arginin-Reste vermittelt wird. Durch Verwendung biochemischer, biophysikalischer und hochauflösender, struktureller Analysen in Echtzeit wollten wir atomare Informationen über die Phosphorylierung des C-terminalen Teils von Stargazin bekommen und die Abhängigkeit der Lipid-Interaktion von der Phosphorylierung verstehen. Durch rekombinante Expression, Aufreinigung und Kristallisation der isolierten Domäne (sLBD), die für die Bindung des Neurotransmitters verantwortlich ist, konnte ich eine hoch-aufgelöste Kristallstruktur der Glutamat-gebundenen sLBDs in zwei durch kristallografische Symmetrie erzeugte tetramere Anordnungen erhalten. Anschließend analysierten wir die tetrameren Anordnungen genauestens strukturell, biophysikalisch und funktionell mittels elektrophysiologischer Aufnahmen und molekularer Modellierung. Metallbrücken zwischen den LBD-Dimeren und Vernetzung in Abhängigkeit des funktionalen Zustandes des Rezeptors haben es uns ermöglicht, die kompaktere der beiden tetrameren LBD Anordnungen als einen Zustand zu identifizieren, der im Zuge der Rezeptor-Aktivierung auch im volle-Länge Rezeptor eingenommen wird, entweder von partiell oder von komplett Glutamat-gebundenen LBDs. Darüber hinaus konnten mittels statischer Lichtstreuung Zink-abhängige Oligomere in Lösung erhalten werden. Diese Studie gibt damit Einblicke in die komplexen LBD Bewegungen und konformationellen Änderungen als Tetramer bei Aktivierung des Rezeptors. Um die Bedeutung der Phosphorylierung der C-terminalen Domäne von Stargazin zu untersuchen, habe ich den kompletten 120 Reste langen und ungefaltenen C-Terminus von Stargazin rekombinant exprimiert und aufgereinigt. Unterschiedlich getaggte Proteinvarianten wurden exprimiert und ihre Aufreinigung wurde optimiert, sodass zum erstmals der komplette und ungetaggte C-Terminus von Stargazin generiert werden konnte, um ihn anschließend für biochemische, biophysikalische und strukturelle Charakterisierungen zu verwenden. Ich konnte so zeigen, dass die C-terminale Domäne von Stargazin elektrostatisch an negativ geladene Liposomen bindet. Mittels massenspektrometrischer Untersuchungen und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) fand ich heraus, dass der C-Terminus von Stargazin quantitativ phosphoryliert wird von der Ca2 +/calmodulin-abhängigen Kinase (CaMKII) und dass die Phosphorylierung die Bindung von Stargazin an die Lipid Membran zerstört, wobei ein phosphorylierter Serin-Rest ausreicht um die Fähigkeit Stargazins, an Liposomen zu binden, um 50% zu reduzieren. Diese Ergebnisse lassen uns annehmen, dass Stargazin als Typ I TARP einen verstellbaren molekularen Widerstandsregler darstellt, der eine graduelle Änderung der synaptischen Stärke erlaubt.