Unraveling spermatogenesis: Gene expression profiling with DNA microarrays reveals genes critical for germ cell development, fertilization and stem cell maintenance

Abstract

Knowledge of mammalian spermatogenesis and the events surrounding fertilization has advanced slowly due in part to uncertainty about the number and identity of the cellular components involved. Some of the genes responsible for differentiation have been characterized, but a greater number of genes have not yet been identified. Critical to our understanding the processes of stem cell renewal and spermatogenesis is an initial description of those genes that are activated or repressed at each stage of germ cell development. Such a description would greatly facilitate the establishment of an in vitro culture system that would allow manipulation of spermatogonial stem cells. Targeted gene disruption is so far only possible in the mouse, because of the inability to culture pluripotent embryonic stem cells in other species. Genetically modified sperm cells could allow gene disruption in the rat and other animals. Generating a gene expression profile of developing germ cells would also lead to the identification of gene products that may play a critical role in fertilization. Determination of genes expressed by germ cells during spermatogenesis, their expression patterns during differentiation in vivo and in vitro, and their cell type specificity should provide an inclusive list of probable critical proteins.

Here, DNA microarrays were used to identify genes potentially involved in the different phases of spermatogenesis. DNA microarrays allow the reliable analysis of the expres¬sion levels of tens of thousands of genes simultaneously and therefore are an excellent tool to comprehensively identify and study the genes involved in spermatogenesis. The initial approach of generating mouse testis-specific cDNA microarrays yielded promising preliminary results. However, when compared to the Affymetrix gene expression plat¬form, these custom-made microarrays turned out to be less reliable, less sensitive, less efficient, and overall more cost-intensive. Through the use of Affymetrix oligonucleotide microarrays, we analyzed mouse and rat gene expression during germ cell differentia¬tion in vivo and in vitro. The results provide an invaluable depository of genes that could be specifically involved in spermatogenesis and fertilization.

In order to identify genes enriched in spermatogonial stem cells, we determined gene expression profiles of cultured rat germ cells using culture conditions under which male germ cells lose (on STO fibroblasts) or maintain (on MSC-1 Sertoli cells) stem cell activ¬ity. Numerous germ cell transcripts strikingly decrease in relative abundance as a func¬tion of testis age or culture time on STO feeder cells, but only a subset of approximately 250 genes remain elevated when cultured on MSC-1 feeder cells. If specific gene ex¬pression regulates stem cell activity, some or all of these transcripts are candidates to be such regulators. Based on this list of marker genes we established a spermatogonial stem cell index that reliably predicts relative stem cell activity in rat and mouse testis cell cultures. These molecular markers now provide a reliable and rapid means by which to define spermatogonial stem cells in culture and could alleviate the need for laborious testicular transfers, the current means by which to define spermatogonial stem cell char¬acter. This will most certainly accelerate the development of advanced culture condi¬tions. Expansion of spermatogonial stem cells in vitro would allow genomic modifications of germ cells and could make targeted gene disruption possible in animals other than the mouse.

Interestingly, when comparing the genes enriched in spermatogonial stem cells to genes that were identified to be commonly enriched in other types of stem cells, e.g. embry¬onic, neural, or hematopoietic, we found very little overlap. Part of the discrepancies may be explained by technical differences or insufficient purity of the individual stem cell populations. Other studies however suggest that there may be very few commonalities in gene expression between different types of stem cells. Whether there actually is a com¬mon set of genes enriched in all stem cells remains questionable at this point.

Furthermore, we gathered expression data of approximately 20,000 genes in the mouse testis at several time points during postnatal development. Removing transcripts found in cultures enriched in Sertoli or testicular interstitial cells yielded a germ cell-enriched transcript profile. Cluster analysis of these transcripts revealed more than 1500 genes whose transcript abundance increased markedly during and after meiosis. Remarkably, nearly 20% of these genes appear to be expressed only in the male germ line. Germ cell-specific transcripts are much less common earlier in germ cell development. Further analysis of the NCBI Unigene database coupled with quantitative real-time PCR indi¬cates that approximately 4% of the mouse genome is dedicated to expression in post-meiotic male germ cells. Approximately two thirds of these genes are still fully unchar¬acterized. Most or many of the protein products of these transcripts are probably re¬tained in mature spermatozoa. Targeted disruption of 19 of these genes has indicated that a majority has roles critical for normal fertility. Thus, we find an astonishing number of genes expressed specifically by male germ cells late in development. This extensive group provides a plethora of potential targets for germ cell-directed contraception and a staggering number of candidate proteins that could be critical for fertilization.

Oligonucleotide microarrays proved to be the ideal tool to study gene expression of spermatogonial stem cells and differentiating germ cells. Compared to similar studies performed with different methods, e.g. cDNA microarrays, differential display, or SAGE, we generated by far the most comprehensive collection of gene expression data. These data will prove extremely valuable in the quest for a spermatogonial culture system and in the unraveling of spermatogenesis and fertilization.

Der Wissensstand zur Spermatogenese und Befruchtung entwickelt sich nur langsam weiter. Ein Grund dafür liegt darin, dass man nicht weiß, welche und wie viele Komponenten an diesen Prozessen beteiligt sind. Einige Gene und ihre Regulation sind inzwischen zwar bekannt, aber den Großteil gilt es noch zu entdecken. Um die Prozesse der Stammzellerneuerung und der Spermatogenese besser zu verstehen, ist es notwendig, eine vollständige Liste der Gene, die in in den jeweiligen Differenzierungsstadien an- oder ausgeschaltet werden, zu erstellen. Dieses Wissen würde die Entwicklung eines Kultursystems für Keimzellen vorantreiben und die Manipulation von Gameten ermöglichen. Das gezielte Entfernen von Genen (Knockout) ist zur Zeit nur in der Maus durchführbar, denn nur hier ist es möglich, embryonale Stammzellen in Kultur zu halten. Genetisch modifizierte Keimzellen könnten einen alternativen Weg zur Erzeugung von Knockouts in der Ratte und anderen Säugetieren bieten. Die Erstellung von Genexpressionsprofilen von männlichen Keimzellen in Zellkultur und während ihrer Entwicklung zu reifen Spermien im Hoden würde auch zur Entdeckung von Proteinen führen, die Schlüsselrollen in der Spermatogenese und bei der Befruchtung spielen.

Zur Entdeckung der Gene, die an den verschiedenen Phasen der Spermatogenese beteiligt sind, haben wir cDNA-Mikroarrays benutzt. DNA-Mikroarrays ermöglichen die simultane Ermittlung der Expressionslevel von zehntausendenden Genen und boten daher eine ausgezeichnete Methode, um die Gene der Spermatogenese zu untersuchen. Unser erster Ansatz bestand in der Herstellung von Mikroarrays mit hodenspezifischen Genen der Maus. Die Anwendung dieser Mikroarrays lieferte zwar vielversprechende Ergebnisse, im Vergleich zu Produkten von kommerziellen Anbietern erwiesen sich unsere Mikroarrays jedoch als weit weniger verlässlich und effizient, weniger empfindlich und teurer. Mit Affymetrix Genchips (Maus und Ratte) haben wir dann die Genexpression während der Differenzierung von Keimzellen in vivo und in vitro analysiert. Das Ergebnis ist eine Datensammlung von beträchtlichem Wert, welche einen Großteil der an den Prozessen der Spermatogenese und Befruchtung beteiligten Gene enthält.

Um die Gene zu identifizieren, die in den Stammzellen der Spermatogenese stärker exprimiert sind als in differenzierten Gameten, haben wir Genexpressionsprofile von Keimzellen der Ratte unter verschiedenen Bedingungen in Zellkultur erstellt. In Kultur auf STO-Fibroblasten verlieren die Zellen ihren Stammzellcharakter, auf MSC-1-Sertolizellen dagegen behalten sie ihn. Der Expressionslevel einer großen Anzahl von Genen sinkt in Kultur auf STO- Zellen und im Hoden während der ersten Welle der Spermatogenese; in Kultur auf MSC-1-Zellen zeigt aber nur eines Bruchteil dieser Gene (ca. 250) konstante Expressionslevel. Sollte die Expression spezifischer Gene die Stammzellfunktion regulieren, dann sind diese Gene potentielle Regulatoren. Auf der Basis dieser Markergene haben wir einen Stammzellindex für Spermatogonien erstellt, welcher Stammzellaktivität in der Ratte und der Maus voraussagt. Diese Genmarker bieten uns jetzt ein verlässliches und schnelles Mittel, Stammzellen in Kultur zu identifizieren, und könnten den aufwendigen Transfers von Keimzellen in einen Empfängerhoden, die derzeitige Methode, mit der der Stammzellcharakter von Spermatogonien bestimmt wird, ersetzen. Dadurch wird sicherlich die Entwicklung von verbesserten Kulturbedingungen beschleunigt. Die Expansion von Stammzellen der Spermatogenese in vitro würde genomische Modifikationen an diesen Zellen zulassen, was wiederum Gen-Knockout in anderen Säugetieren als Mäusen ermöglichen könnte.

Vergleicht man die Gene, die in Stammzellen der Spermtogenese erhöht exprimiert sind, mit denen anderer Stammzelltypen, z.B. embryonalen, neuronalen oder hämatopoetischen Stammzellen, findet man nur sehr wenig Überschneidung. Diese Diskrepanz kann teilweise durch technische Unterschiede oder durch geringe Reinheit der verschiedenen Stammzellpopulationen erklärt werden. Allerdings legen andere Studien nahe, dass es in Bezug auf die Genexpression nur wenige Gemeinsamkeiten zwischen verschiedenen Stammzelltypen gibt. Ob es tatsächlich einen Satz Gene gibt, der in allen Stammzelltypen erhöht exprimiert ist, ist im Moment fraglich.

Wir haben außerdem Expressionsdaten von ca. 20000 Genen im Hoden der Maus während unterschiedlicher Zeitpunkte in der postnatalen Entwicklung ermittelt. Durch Subtraktion der Gene, die in Sertolizellen und den interstitiellen Zellen des Hoden exprimiert sind, konnten wir ein Expressionsprofil der Keimzellen während der Spermatogenese erstellen. Durch Clusteranalyse der Expressionsmuster stießen wir auf mehr als 1500 Ge-ne, deren Expression deutlich mit Beginn der Meiose und der Spermiohistogenese ansteigt. Bemerkenswerterweise scheinen fast 20% dieser Gene nur in der männlichen Keimbahn exprimiert zu sein. Keimzell-spezifische Gene sind dagegen in der frühen Keimzellentwicklung selten. Durch Auswerung der NCBI Unigene Datenbank, gekoppelt mit quantitativer Real-Time PCR, lässt sich ableiten, dass ca. 4% des Genoms der Maus ausschließlich der Expression von post-meiotischen Transkripten gewidmet ist. Ungefähr zwei Drittel dieser Gene sind noch vollständig unerforscht. Die meisten der entsprechenden Proteine sind möglicherweise in reifen Spermatozoen zu finden. Die Ergebnisse von Knockouts an 19 dieser Gene erlauben die Schlussfolgerung, dass die Mehrzahl ein bedeutende Rolle für die Fruchtbarkeit spielt. Wir haben eine erstaunlich große Zahl an Genen identifiziert, die ganz spezifisch von männlichen Keimzellen spät in ihrer Entwicklung exprimiert sind. Diese Liste bietet eine Fülle potentieller Ziele für nicht-hormonelle Verhütungsmittel für den Mann und eine große Anzahl an Genen, die möglicherweise wichtig für die Befruchtung sind.

Oligonucleotid-Mikroarrays haben sich als die ideale Methode zur Untersuchung der Genexpression von Stammzellen der Spermatogenese und der verschiedenen Differenzierungsstadien der Keimzellen herausgestellt. Im Vergleich zu anderen Studien, die anderen Methoden benutzten, haben wir die bei weitem umfangreichste Datensammlung erstellt. Diese Daten werden sich als extrem wertvoll bei der Suche nach einem Zellkultursystem für Keimzellen erweisen und uns wichtige Hinweise zur Entschlüsselung der Spermatogenese und Befruchtung geben.