dc.contributor.author
Schultz, Nikolaus
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:11:13Z
dc.date.available
2004-07-14T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7509
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11708
dc.description
Title pages
1 Introduction 1
1.1 Spermatogenesis and fertilization 1
1.1.1 The testis 1
1.1.2 Spermatogenesis 1
Spermatogonial stage 2
Meiotic stage 4
Spermiogenesis stage 4
Synchronization of the spermatogonial stages 5
1.1.3 Fertilization 6
1.2 Gene expression in the testis 8
1.3 The spermatogonial stem cell 10
1.4 Gene expression profiling 12
1.4.1 DNA microarrays 12
Sample labeling 13
Universal control samples 15
Affymetrix GeneChips 15
Detection limit and RNA amplification 16
Microarray data analysis and publication guidelines 17
1.4.2 Other techniques for global gene expression profiling 18
1.4.3 Verification of expression changes of individual genes 19
2 Formulation of the problem 22
3 Materials 24
3.1 Chemicals 24
3.2 Nucleotides, nucleic acids and primers 24
3.3 Plasmids 24
3.4 Antibodies 25
3.5 Animals and cell lines 25
3.6 Tissue culture reagents and materials 25
3.7 Microarray materials 25
3.8 Other materials 26
3.9 Software 26
4 Methods 27
4.1 Mouse testis cDNA microarrays 27
4.1.1 Generation of testis-specific cDNA microarrays 27
4.1.2 Use of testis-specific cDNA microarrays 28
Sample labeling 28
Hybridization and washing 29
Microarray scanning 29
4.2 Gene expression analysis of mouse spermatogenesis 30
4.2.1 Biological material and RNA isolation 30
GCS-GFP rat 30
Testis samples 30
Testicular cell cultures 30
4.2.2 Microarray processing 31
4.2.3 Data analysis and clustering 31
Analysis of testis samples 31
Analysis of cultured rat germ cells 32
Identification of mouse homologues to rat genes 32
4.2.4 Quantitative real-time PCR 32
4.2.5 In situ hybridization 33
4.2.6 Feeder cell lines 33
4.2.7 Germ cell transplantation and progeny genotyping 34
4.2.8 Fluorometric analysis of germ stem cell activity 34
4.2.9 Western blot analysis 35
4.2.10 Immunocytochemistry 35
4.2.11 Electron microscopy 36
5 Results 37
5.1 Generation and use of testis-specific cDNA microarrays 37
5.2 Gene expression analysis of mouse spermatogenesis 41
5.2.1 Gene expression patterns 41
5.2.2 Analyzing tissue specificity 44
5.2.3 Mining the Unigene database for testis-specific genes 46
5.3 The spermatogonial stem cell 48
5.3.1 Testicular cell cultures 48
5.3.2 Testis colonization assay 52
5.3.3 Investigation of feeder cell lines 53
5.3.4 Germ cell differentiation on STO feeder layer 55
5.3.5 Spermatogonial stem cell index 58
5.3.6 Characterization of Egr3 protein expression 60
6 Discussion 62
6.1 Gene expression analysis of mouse spermatogenesis 62
6.2 The spermatogonial stem cell 70
6.2.1 Spermatogonial stem cell genes 70
6.2.2 Comparison with other stem cells 74
7 Summary 77
Zusammenfassung 79
References 82
Supplemental Tables 92
List of own publications 96
Acknowledgments 98
dc.description.abstract
Knowledge of mammalian spermatogenesis and the events surrounding
fertilization has advanced slowly due in part to uncertainty about the number
and identity of the cellular components involved. Some of the genes
responsible for differentiation have been characterized, but a greater number
of genes have not yet been identified. Critical to our understanding the
processes of stem cell renewal and spermatogenesis is an initial description
of those genes that are activated or repressed at each stage of germ cell
development. Such a description would greatly facilitate the establishment of
an in vitro culture system that would allow manipulation of spermatogonial
stem cells. Targeted gene disruption is so far only possible in the mouse,
because of the inability to culture pluripotent embryonic stem cells in other
species. Genetically modified sperm cells could allow gene disruption in the
rat and other animals. Generating a gene expression profile of developing germ
cells would also lead to the identification of gene products that may play a
critical role in fertilization. Determination of genes expressed by germ cells
during spermatogenesis, their expression patterns during differentiation in
vivo and in vitro, and their cell type specificity should provide an inclusive
list of probable critical proteins.
Here, DNA microarrays were used to identify genes potentially involved in the
different phases of spermatogenesis. DNA microarrays allow the reliable
analysis of the expres¬sion levels of tens of thousands of genes
simultaneously and therefore are an excellent tool to comprehensively identify
and study the genes involved in spermatogenesis. The initial approach of
generating mouse testis-specific cDNA microarrays yielded promising
preliminary results. However, when compared to the Affymetrix gene expression
plat¬form, these custom-made microarrays turned out to be less reliable, less
sensitive, less efficient, and overall more cost-intensive. Through the use of
Affymetrix oligonucleotide microarrays, we analyzed mouse and rat gene
expression during germ cell differentia¬tion in vivo and in vitro. The results
provide an invaluable depository of genes that could be specifically involved
in spermatogenesis and fertilization.
In order to identify genes enriched in spermatogonial stem cells, we
determined gene expression profiles of cultured rat germ cells using culture
conditions under which male germ cells lose (on STO fibroblasts) or maintain
(on MSC-1 Sertoli cells) stem cell activ¬ity. Numerous germ cell transcripts
strikingly decrease in relative abundance as a func¬tion of testis age or
culture time on STO feeder cells, but only a subset of approximately 250 genes
remain elevated when cultured on MSC-1 feeder cells. If specific gene
ex¬pression regulates stem cell activity, some or all of these transcripts are
candidates to be such regulators. Based on this list of marker genes we
established a spermatogonial stem cell index that reliably predicts relative
stem cell activity in rat and mouse testis cell cultures. These molecular
markers now provide a reliable and rapid means by which to define
spermatogonial stem cells in culture and could alleviate the need for
laborious testicular transfers, the current means by which to define
spermatogonial stem cell char¬acter. This will most certainly accelerate the
development of advanced culture condi¬tions. Expansion of spermatogonial stem
cells in vitro would allow genomic modifications of germ cells and could make
targeted gene disruption possible in animals other than the mouse.
Interestingly, when comparing the genes enriched in spermatogonial stem cells
to genes that were identified to be commonly enriched in other types of stem
cells, e.g. embry¬onic, neural, or hematopoietic, we found very little
overlap. Part of the discrepancies may be explained by technical differences
or insufficient purity of the individual stem cell populations. Other studies
however suggest that there may be very few commonalities in gene expression
between different types of stem cells. Whether there actually is a com¬mon set
of genes enriched in all stem cells remains questionable at this point.
Furthermore, we gathered expression data of approximately 20,000 genes in the
mouse testis at several time points during postnatal development. Removing
transcripts found in cultures enriched in Sertoli or testicular interstitial
cells yielded a germ cell-enriched transcript profile. Cluster analysis of
these transcripts revealed more than 1500 genes whose transcript abundance
increased markedly during and after meiosis. Remarkably, nearly 20% of these
genes appear to be expressed only in the male germ line. Germ cell-specific
transcripts are much less common earlier in germ cell development. Further
analysis of the NCBI Unigene database coupled with quantitative real-time PCR
indi¬cates that approximately 4% of the mouse genome is dedicated to
expression in post-meiotic male germ cells. Approximately two thirds of these
genes are still fully unchar¬acterized. Most or many of the protein products
of these transcripts are probably re¬tained in mature spermatozoa. Targeted
disruption of 19 of these genes has indicated that a majority has roles
critical for normal fertility. Thus, we find an astonishing number of genes
expressed specifically by male germ cells late in development. This extensive
group provides a plethora of potential targets for germ cell-directed
contraception and a staggering number of candidate proteins that could be
critical for fertilization.
Oligonucleotide microarrays proved to be the ideal tool to study gene
expression of spermatogonial stem cells and differentiating germ cells.
Compared to similar studies performed with different methods, e.g. cDNA
microarrays, differential display, or SAGE, we generated by far the most
comprehensive collection of gene expression data. These data will prove
extremely valuable in the quest for a spermatogonial culture system and in the
unraveling of spermatogenesis and fertilization.
de
dc.description.abstract
Der Wissensstand zur Spermatogenese und Befruchtung entwickelt sich nur
langsam weiter. Ein Grund dafür liegt darin, dass man nicht weiß, welche und
wie viele Komponenten an diesen Prozessen beteiligt sind. Einige Gene und ihre
Regulation sind inzwischen zwar bekannt, aber den Großteil gilt es noch zu
entdecken. Um die Prozesse der Stammzellerneuerung und der Spermatogenese
besser zu verstehen, ist es notwendig, eine vollständige Liste der Gene, die
in in den jeweiligen Differenzierungsstadien an- oder ausgeschaltet werden, zu
erstellen. Dieses Wissen würde die Entwicklung eines Kultursystems für
Keimzellen vorantreiben und die Manipulation von Gameten ermöglichen. Das
gezielte Entfernen von Genen (Knockout) ist zur Zeit nur in der Maus
durchführbar, denn nur hier ist es möglich, embryonale Stammzellen in Kultur
zu halten. Genetisch modifizierte Keimzellen könnten einen alternativen Weg
zur Erzeugung von Knockouts in der Ratte und anderen Säugetieren bieten. Die
Erstellung von Genexpressionsprofilen von männlichen Keimzellen in Zellkultur
und während ihrer Entwicklung zu reifen Spermien im Hoden würde auch zur
Entdeckung von Proteinen führen, die Schlüsselrollen in der Spermatogenese und
bei der Befruchtung spielen.
Zur Entdeckung der Gene, die an den verschiedenen Phasen der Spermatogenese
beteiligt sind, haben wir cDNA-Mikroarrays benutzt. DNA-Mikroarrays
ermöglichen die simultane Ermittlung der Expressionslevel von zehntausendenden
Genen und boten daher eine ausgezeichnete Methode, um die Gene der
Spermatogenese zu untersuchen. Unser erster Ansatz bestand in der Herstellung
von Mikroarrays mit hodenspezifischen Genen der Maus. Die Anwendung dieser
Mikroarrays lieferte zwar vielversprechende Ergebnisse, im Vergleich zu
Produkten von kommerziellen Anbietern erwiesen sich unsere Mikroarrays jedoch
als weit weniger verlässlich und effizient, weniger empfindlich und teurer.
Mit Affymetrix Genchips (Maus und Ratte) haben wir dann die Genexpression
während der Differenzierung von Keimzellen in vivo und in vitro analysiert.
Das Ergebnis ist eine Datensammlung von beträchtlichem Wert, welche einen
Großteil der an den Prozessen der Spermatogenese und Befruchtung beteiligten
Gene enthält.
Um die Gene zu identifizieren, die in den Stammzellen der Spermatogenese
stärker exprimiert sind als in differenzierten Gameten, haben wir
Genexpressionsprofile von Keimzellen der Ratte unter verschiedenen Bedingungen
in Zellkultur erstellt. In Kultur auf STO-Fibroblasten verlieren die Zellen
ihren Stammzellcharakter, auf MSC-1-Sertolizellen dagegen behalten sie ihn.
Der Expressionslevel einer großen Anzahl von Genen sinkt in Kultur auf STO-
Zellen und im Hoden während der ersten Welle der Spermatogenese; in Kultur auf
MSC-1-Zellen zeigt aber nur eines Bruchteil dieser Gene (ca. 250) konstante
Expressionslevel. Sollte die Expression spezifischer Gene die
Stammzellfunktion regulieren, dann sind diese Gene potentielle Regulatoren.
Auf der Basis dieser Markergene haben wir einen Stammzellindex für
Spermatogonien erstellt, welcher Stammzellaktivität in der Ratte und der Maus
voraussagt. Diese Genmarker bieten uns jetzt ein verlässliches und schnelles
Mittel, Stammzellen in Kultur zu identifizieren, und könnten den aufwendigen
Transfers von Keimzellen in einen Empfängerhoden, die derzeitige Methode, mit
der der Stammzellcharakter von Spermatogonien bestimmt wird, ersetzen. Dadurch
wird sicherlich die Entwicklung von verbesserten Kulturbedingungen
beschleunigt. Die Expansion von Stammzellen der Spermatogenese in vitro würde
genomische Modifikationen an diesen Zellen zulassen, was wiederum Gen-Knockout
in anderen Säugetieren als Mäusen ermöglichen könnte.
Vergleicht man die Gene, die in Stammzellen der Spermtogenese erhöht
exprimiert sind, mit denen anderer Stammzelltypen, z.B. embryonalen,
neuronalen oder hämatopoetischen Stammzellen, findet man nur sehr wenig
Überschneidung. Diese Diskrepanz kann teilweise durch technische Unterschiede
oder durch geringe Reinheit der verschiedenen Stammzellpopulationen erklärt
werden. Allerdings legen andere Studien nahe, dass es in Bezug auf die
Genexpression nur wenige Gemeinsamkeiten zwischen verschiedenen Stammzelltypen
gibt. Ob es tatsächlich einen Satz Gene gibt, der in allen Stammzelltypen
erhöht exprimiert ist, ist im Moment fraglich.
Wir haben außerdem Expressionsdaten von ca. 20000 Genen im Hoden der Maus
während unterschiedlicher Zeitpunkte in der postnatalen Entwicklung ermittelt.
Durch Subtraktion der Gene, die in Sertolizellen und den interstitiellen
Zellen des Hoden exprimiert sind, konnten wir ein Expressionsprofil der
Keimzellen während der Spermatogenese erstellen. Durch Clusteranalyse der
Expressionsmuster stießen wir auf mehr als 1500 Ge-ne, deren Expression
deutlich mit Beginn der Meiose und der Spermiohistogenese ansteigt.
Bemerkenswerterweise scheinen fast 20% dieser Gene nur in der männlichen
Keimbahn exprimiert zu sein. Keimzell-spezifische Gene sind dagegen in der
frühen Keimzellentwicklung selten. Durch Auswerung der NCBI Unigene Datenbank,
gekoppelt mit quantitativer Real-Time PCR, lässt sich ableiten, dass ca. 4%
des Genoms der Maus ausschließlich der Expression von post-meiotischen
Transkripten gewidmet ist. Ungefähr zwei Drittel dieser Gene sind noch
vollständig unerforscht. Die meisten der entsprechenden Proteine sind
möglicherweise in reifen Spermatozoen zu finden. Die Ergebnisse von Knockouts
an 19 dieser Gene erlauben die Schlussfolgerung, dass die Mehrzahl ein
bedeutende Rolle für die Fruchtbarkeit spielt. Wir haben eine erstaunlich
große Zahl an Genen identifiziert, die ganz spezifisch von männlichen
Keimzellen spät in ihrer Entwicklung exprimiert sind. Diese Liste bietet eine
Fülle potentieller Ziele für nicht-hormonelle Verhütungsmittel für den Mann
und eine große Anzahl an Genen, die möglicherweise wichtig für die Befruchtung
sind.
Oligonucleotid-Mikroarrays haben sich als die ideale Methode zur Untersuchung
der Genexpression von Stammzellen der Spermatogenese und der verschiedenen
Differenzierungsstadien der Keimzellen herausgestellt. Im Vergleich zu anderen
Studien, die anderen Methoden benutzten, haben wir die bei weitem
umfangreichste Datensammlung erstellt. Diese Daten werden sich als extrem
wertvoll bei der Suche nach einem Zellkultursystem für Keimzellen erweisen und
uns wichtige Hinweise zur Entschlüsselung der Spermatogenese und Befruchtung
geben.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
spermatogenesis gene expression profiling microarrays
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Unraveling spermatogenesis
dc.contributor.firstReferee
Prof. David Garbers
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Volker Erdmann
dc.date.accepted
2004-06-18
dc.date.embargoEnd
2004-07-14
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2004001784
dc.title.subtitle
Gene expression profiling with DNA microarrays reveals genes critical for germ
cell development, fertilization and stem cell maintenance
dc.title.translated
Entschlüsselung der Spermatogenese
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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