The Effects of Enamel Matrix Derivative (EMD) on the Regulation of Connective Tissue Growth factor (CTGF) Expression in Human Osteoblastic Cells via TGF-ß pathway.: Enamel matrix derivative induces CTGF expression.

Abstract

Enamel matrix derivative (EMD) stimulates the production of transforming growth factor-beta (TGF-ß), which is suggested to play a role in mediating the effects of EMD in periodontal tissue regeneration. Connective tissue growth factor (CTGF) is a mediator of TGF-ß and promotes cell development. The interaction between EMD and CTGF is still unknown. This study explores the effects of EMD on CTGF expression in human osteoblastic cells and whether the interaction is modulated by TGF-ß signaling pathway. Also, the roles of CTGF in cell proliferation, cell cycle progression and mineralized nodule formation of EMD-induced osteoblastic cultures are examined. Human osteoblastic cells (Saos-2) were treated with 25-100 µg/ml EMD with or without the addition of TGF-ß inhibitor. CTGF mRNA expression was detected by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and CTGF protein levels were assayed by Western Blot analysis. In addition, cell cycle progression and DNA synthesis were determined by flow cytometry (FACS) and BrdU incorporation following EMD treatment, with or without CTGF antibody. Mineralisation was examined by alizarin red staining and quantified by elution with cetylpyridinium chloride. Western blot and RT-PCR analysis demonstrated a dose-dependent increase of CTGF expression by EMD. EMD-induced CTGF expression was significantly reduced in the presence of TGF-ß inhibitor. Both cell cycle and BrdU analysis revealed an increase of cell proliferation following EMD treatment, due to an increase of the percentage of cells in the G2/M phase of the cell cycle. No significant effect was found when anti-CTGF antibody added. On the other hand, in the presence of the anti-CTGF antibody, mineralization was significantly inhibited in EMD-treated cultures. The present study demonstrates that EMD stimulates CTGF expression and the interaction is modulated via TGF-ß in osteoblastic cells. Also, CTGF affects EMD-induced osteoblastic mineralization but not cell proliferation. These results provide a novel insight on the EMD-CTGF interaction, two biomodifiers that have therapeutic relevance to tissue engineering and regeneration.

Schmelzmatrix Proteinderivate (EMD) simulieren die Produktion des Wachstumsfaktors Transforming Growth Factor-beta (TGF-ß), das die EMD- induzierten Effekte in der parodontalen Regeneration maßgeblich kontrolliert. Connective Tissue Growth Factor (CTGF) ist ein Mediator des TGF-ß, das die Zellproliferation und extrazelluläre Matrixproduktion fördert. Der Einfluss von EMD auf die CTGF Expression in Osteoblasten ist jedoch nicht bekannt. Aus diesem Grund ist das Ziel dieser Studie den Effekt von EMD auf die Expression von CTGF sowie den Einfluss von TGF-ß in humanen Osteoblasten zu untersuchen. Außerdem wird die Bedeutung von CTGF für die EMD-induzierte Zellproliferation, Zell Zyklus Progression und Mineralization analysiert. Humane Osteoblasten (Saos-2) wurden mit 25-100µg/ml EMD mit und ohne Zusatz von 0.1µg/ml TGF-ß Inhibitor in serumfreien Kulturmedium behandelt. Die CTGF mRNA Expression wurde mittels RT-PCR analysiert. Die CTGF Proteinexpression wurde mittels Western Blot Analyse untersucht und densitometrisch quantifiziert. Um den Effekt von CTGF auf die EMD-induzierte Zellproliferation bzw. Progression des Zellzyklus zu ermitteln, wurden die Zellen mit 25-100µg/ml EMD mit und ohne Zusatz von 0.5µg/ml CTGF Inhibitor behandelt und mittels BrdU ELISA sowie mittels FACS Analyse untersucht. Die Effekt auf die EMD-induzierte Mineralization wurde mittels Alizarin Rot Färbung untersucht und densitometrisch quantifiziert. Die RT-PCR und Western blot Analysen zeigen eine konzentrationsabhängige Zunahme der CTGF mRNA und Proteinexpression durch EMD. Die Zugabe des TGF-ß Inhibitors reduzierte signifikant die EMD-induzierte CTGF Expression, was auf eine Modulation der EMD-induzierten CTGF Expression über die TGF-ß Signalkaskade hindeutet. Die BrdU Analyse zeigte eine 2,5-fache Stimulation der DNA Synthese durch EMD, allerdings hatte die Zugabe des CTGF Inhibitors keinen Effekt. Dies konnte mittels FACS Analyse bestätigt werden. Die Alizarin Rot Analyse zeigte, die Zugabe des CTGF Antikörper reduzierte signifikant die EMD-induzierte Mineralization. Zusammenfassend stimuliert EMD die CTGF Expression und diese Interaktion scheint durch TGF-ß moduliert zu werden. CTGF hat eine Effekt in die EMD-induzierte Mineralization aber die EMD-induzierte Stimulation der Zellproliferation wird allerdings nicht durch CTGF reguliert. Diese Ergebnisse liefern einen neuen Einblick in die Interaktion zwischen EMD und CTGF, zwei Biomodifikatoren, die eine entscheidende Bedeutung für das Tissue Engineering und die parodontale Regeneration haben.