Oberflächenmodifizierte proteinbeladene Mikropartikel für das Targeting dendritischer Zellen

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden proteinbeladene, biodegradable Mikropartikel aus Poly(Lactid-co-Glycolid) [PLGA] in einem Mikromischer-basierten Doppelemulsions-Lösemittelverdampfung-Verfahren unter aseptischen Bedingungen hergestellt sowie die Partikel umfassend charakterisiert. Die Primäremulgierung des Modellproteins FITC-BSA in der Lösung des Matrixpolymers wurde unter Berücksichtigung der Ultrastruktur der Mikropartikel, der Proteinverteilung sowie des Freisetzungsverhaltens optimiert. Der Restlösungsmittelgehalt unterschritt den Grenzwert des Arzneibuches für Dichlormethan um drei Zehnerpotenzen. Die Verwendung des Modellproteins FITC- BSA ermöglichte bei Untersuchungen zur Proteinverteilung im Mikropartikel und zur Partikellokalisation im Zellexperiment zahlreiche Schlussfolgerungen, hingegen schlug die fluorimetrische Quantifizierung des FITC-BSA in Freisetzungsproben aufgrund von Dequenching fehl. Zur kationischen Oberflächenmodifizierung von PLGA-Mikropartikeln wurde erstmals DEAE-Dextran eingesetzt. Bei den DEAE-Dextran-ummantelten Teilchen konnte im Gegensatz zu Chitosan-modifizierten Partikeln auch bei pH 7 eine positive Ladung festgestellt werden. Die in der Literatur beschriebene Methode zur Oberflächenmodifizierung mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) war nicht nachvollziehbar, da CTAB von der Partikeloberfläche desorbierte. In Zellexperimenten wurden die DEAE-Dextran-modifizierten Mikropartikel effektiver als unmodifizierte Partikel in phagozytierende Zellen aufgenommen. Die PLGA-Mikropartikel lösten bei Abwesenheit von Endotoxinen und anderen starken Antigenen keine Reifung von humanen dendritischen Zellen (DCs) oder Veränderungen in der Expression ihrer Oberflächenmarker aus und besaßen bei den verwendeten Konzentrationen keine Zytotoxizität. Damit stellen PLGA- Mikropartikel ein sicheres Trägersystem dar, um Antigene in DCs einzuschleusen. Für eine verbesserte immunologische Tumortherapie sollte die Antigenpulsung autologer DCs mit mikroverkapselten Antigenen erfolgen. Zukünftig könnten an DEAE-Dextran-modifizierte Mikropartikel Liganden von Toll-like Rezeptoren gebunden werden, die die nachgeschaltete Immunantwort verstärken und zu einer verbesserten Wirksamkeit DC-basierter Zelltherapien führen könnten.

The present contribution describes the preparation of protein loaded, biodegradable microparticles from poly(lactide-co-glycolide) [PLGA] using a double emulsion solvent evaporation technique based on a micromixer under aseptic conditions as well as the comprehensive characterisation of the particles. The primary emulsification of the model protein FITC-BSA in the solution of the PLGA matrix polymer has been optimized under consideration of the ultrastructure of the microparticles, the protein distribution, as well as the release behaviour. The residual solvent in the microparticles was one thousand times smaller than required in the pharmacopoeia. The usage of FITC- BSA as a model protein allowed a number of conclusions with respect to the protein distribution in the microparticles and the localisation of the particles in the cell experiment. However, the fluorimetric quantification of FITC-BSA in samples of release studies failed because of dequenching effects. For a cationic surface modification of PLGA microparticles DEAE dextran has been used for the first time. Contrary to the surface modification with Chitosan the DEAE dextran coated particles had a positive surface charge even at pH 7. A method of cationic surface modification using cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), as described in the literature, could not be reproduced, because CTAB showed desorption from the particle surface. In cell experiments the uptake of DEAE dextran modified particles by phagocytising cells was more efficient than that of non-modified particles. In the absence of endotoxins or other strong antigens PLGA microparticles did not initiate the maturation of human dendritic cells (DCs) or changes in the expression of their surface markers, and did not lead to cytotoxicity under the used concentration of the particles. Thus PLGA microparticles are safe carrier systems to deliver antigens to DCs. For an improved immunological cancer therapy antigen pulsing of autologous DCs should be carried out with microencapsulated antigens. In future studies ligands of Toll-like receptors could be adsorbed to DEAE dextran modified microparticles. This might amplify the immune response and lead to an improved efficiency of DC based cell therapies.