Untersuchungen zur Rolle von Lymphozyten, myeloiden Zellen und des Zytokins Thrombopoietin in der bakteriellen Meningitis

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die Rolle von myeloiden Zellen und die Rolle des Zytokins Thrombopoetin in der bakteriellen Meningitis untersucht. Wesentliche Befunde wurden in einem Mausmodell der bakteriellen Meningitis erhoben. Mit Hilfe dieses Modells können Mechanismen der Inflammation auf zellulärer und Zytokinebene sowie der neuronale Schaden untersucht werden. In Abhängigkeit von der Fragestellung wurden zur Auslösung der Meningitis lebende Pneumokokken, das synthetische bakterielle Lipopeptid Pam3CysSK4 (ein spezifischer Agonist am Toll-Like-Rezeptor 2) oder aktivierte Spenderleukozyten verwendet. In Untersuchungen an Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit homozygoter Ablation des Thrombopoietin-Rezeptors (c-Mpl-/-) zeigte sich 24 h nach der Meningitis-Induktion mit Streptokokkus pneumoniae in den c-Mpl-/--Mäusen eine geringere Dichte apoptotischer Zellkerne in Körnerzellschicht des Gyrus dentatus als bei Wildtyp-Mäusen. Die zusätzliche intrathekale Applikation von rekombinanten Thrombopoietin (TPO) führte in infizierten Wildtyp-Mäusen zu einer Zunahme apoptotischer Neurone im Gyrus dentatus. Diese Befunde deuten auf eine proapoptotische Wirkung von TPO während der bakteriellen Meningitis hin. Ergänzende Zellkulturuntersuchungen an primärer ZNS-Mikroglia und einer Makrophagen-Zelllinie deuteten auf eine wichtige Rolle der bakteriellen Toxine Pneumolysin (Pln) und Wasserstoffperoxid (H2O2) bei der Induktion von TPO in diesen Zellen hin. RAG-1-defiziente Mäuse, denen reife T- und B-Lymphozyten fehlen, zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen 24 h nach der Meningitis-Induktion mit Pam3CysSK4, schwerere klinische Krankheitszeichen und eine verstärkte neutrophile Liquorpleozytose, jedoch einen geringer ausgeprägten neuronalen Gewebeschaden. Eine differentielle Regulierung pro- und antiinflammatorischer Zytokine im Hirngewebe und in den Leukozyten im Subarachnoidalraum deutete auf Kompartiment-spezifische Effekte der Lymphozyten während akuter Meningitis hin, darunter eine Abschwächung der meningealen Inflammation und die Förderung neurotoxischer Eigenschaften aktivierter Mikroglia. Des Weiteren wurde eine Methodik entwickelt, mit der die direkte Aktivierung immunkompetenter Zellen im Subarachnoidalraum durch bakterielle Liganden auf spezifische Zellpopulationen limitiert werden kann. Das Verfahren beruhte auf der Aufreinigung der jeweiligen Zellpopulation aus Wildtyp-Spendermäusen mittels geeigneter Antikörpermarkierung und Isolation nach dem MACS-Prinzip. Nach Stimulation mit dem spezifischen TLR2-Agonisten Pam3CysSK4 wurden die Zellen in den Subarachnoidalraum von TLR2-defizienten Mäusen eingebracht. Direkte proinflammatorische Wirkungen des Liganden im Empfänger waren auf diese Weise ausgeschlossen. Nach Methodenetablierung wurden erste Pilotversuche mit aufgereinigten Splenozytenfraktionen durchgeführt. Im Vergleich zu unstimulierten Zellen lösten mit Pam3CysSK4 stimulierte Ly6G-positiv selektierte Neutrophile keine wirtsseitige Inflammationsreaktion aus, während ein robuster Einstrom von Leukozyten des Empfängertiers durch die negativ selektierte Population oder die wiedervereinigten Fraktionen ausgelöst wurde. Diese präliminären Befunde legen nahe, dass monozytäre Zellen und nicht neutrophile Granulozyten im Subarachoidalraum eine Wächterfunktion gegenüber invadierenden grampositiven Bakterien ausüben.

The present paper reports on investigations of the role of myeloid cells and of the cytokine thrombopoietin in bacterial meningitis. Central results were gathered in a mouse model of bacterial meningitis which allows to investigate mechanisms of inflammation at the cellular and cytokine level as well as neuronal damage. Depending on the question, meningitis was induced using live pneumococci, the synthetic bacterial lipopeptide Pam3CysSK4 (a specific toll- like receptor 2 agonist), or stimulated splenocyte fractions. In experiments on wild-type mice and mice with homozygous ablation of the thrombopoietin receptor (c-Mpl-/-), a lower density of apoptotic neurons in the granular cell layer of the dentate gyrus 24 hours after meningitis induction with Streptococcus pneumoniae was found in the c-Mpl-/- mice when compared to wild- type mice. Intrathecal application of recombinant thrombopoietin (TPO) led to an increase in appoptotic neurons in the dentate gyrus in infected wild-type mice. These findings suggested a proapoptotic effect of TPO during bacterial meningitis. Further studies on primary CNS microglia and a macrophage cell line revealed an important role of the bacterial toxins pneumolysin (Pln) and hydrogen peroxide (H2O2) in inducing TPO expression by these cells. RAG-1-deficient mice lacking mature T and B lymphocytes showed more severe clinical impairment and increased neutrophil concentrations in the cerebrospinal fluid (CSF) compared to wild-type mice 24 h after meningitis induction with Pam3CysSK4. However, neuronal tissue damage was less pronounced. A differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokines in brain tissue and in the leukocytes in the subarachnoid space indicated a compartment-specific effect during acute meningitis. Specifically, an attenuation of meningeal inflammation and the promotion of neurotoxic properties of activated microglia were observed. Furthermore, a methodology was developed to limit the direct activation of immunocompetent cells by bacterial ligands to specific leukocyte populations in the subarachnoid space. The method is based on the purification of the respective cell population from wild-type donors, using magnetic cell sorting (MACS) after appropriate immunolabeling of the target cells. After stimulation with the specific TLR2 agonist Pam3CysSK4, the cells were injected into the subarachnoid space of TLR2-deficient mice, thereby excluding direct proinflammatory effects of the ligand in the recipient. After establishing the method, pilot experiments were conducted using purified splenocyte fractions. Compared to unstimulated cells, Pam3CysSK4-stimulated Ly6G positive-selected neutrophils did not induce an inflammation reaction. Conversely, a robust inflow of host leukocytes was triggered by the negatively selected population or the combined fractions. These preliminary findings suggest that monocytic cells rather than neutrophil granulocytes exert a sentinel function against invading gram-positive bacteria in the subarachoid space.