Massenspektrometrische Methoden für die biochemische Proteomforschung: Identität, Primärstruktur und Prozessierung funktioneller Proteine der bakteriellen Konjugation.

Abstract

In dieser Arbeit werden erstmals systematische Untersuchungen zur geordneten Übertragung von Substanzen auf MALDI-MS Probenträger mit einem, aus mehreren piezoelektrischen Mikrodispensern bestehenden, Robotersystem vorgestellt. Bei Anwendung dieses Mikrodispensierverfahrens müssen nur noch Femtomole an Abbaupeptiden in das Massenspektrometer überführt werden, um die zugrundeliegenden Proteine anhand der Peptidmassen verläßlich zu identifizieren. Dies sind ~ 1 % der bisher benötigten Menge. Zusammen mit dem hier vorgestellten, patentierten, elektroakustischen Mikrotropfendetektionssystem (HARP) lassen sich MALDI-MS-Probenträger mit sehr hoher Probendichte herstellen, die dann vollautomatisch gemessen werden.

Algorithmen zur automatischen Auswertung von MALDI-MS Spektren wurden erstellt und angewendet.

Die Identität funktioneller Proteine des DNA-Transferapparates der bakteriellen Konjugation wurde nach ein- und zweidimensionaler gelelektrophoretischer Trennung, sowie nach Immobilisierung auf Membranen, durch massenspektrometrische Bestimmung der Abbaupeptide belegt. Primärstruktur und komplexchemische Analysen beweisen u.a. daß der Relaxosomenbestandteil, TraH, ein eisenkomplexierendes und das "entry exclusion" vermittelnde TrbK ein Lipo- Protein ist. Außerdem wurde die Abspaltung des bisher nur postulierten Signalpeptids von TrbM bestätigt. Im nichtinduzierten Zustand werden in E. coli Lac-I, TrbG, TraL, TrbJ und TrbM als die am stärksten exprimierten, plasmidkodierten Proteine nachgewiesen.

MALDI-MS Analysen mit Proben ganzer Zellen wurden zur Identifizierung der Hauptkomponente des extrazellulären Pilus optimiert. Mit der üblicher Weise für synthetische Polymere genutzten MALDI-MS Matrix trans-3-Indolylacrylsäure läßt sich das Genprodukt von trbC als Pilushauptkomponente in bisher unerreichter Empfindlichkeit detektieren. Das von RP4 kodierte, in Escherichia coli ribosomal synthetisierte, Pilin wird nach mehrfacher Prozessierung von TraF zu einem 78 Aminosäuren großen zyklischen Molekül umgewandelt. Die ehemaligen N- und C-Termini werden dabei über eine Peptidbindung miteinander verknüpft. Das resultierende Zykloprotein stellt das derzeit weltweit größte bekannte zyklische Polypeptid dar. Das vom Schwesterplasmid R751 kodierte TrbC, sowie das virB2-Genprodukt von Agrobacterium tumefaciens hat eine analoge zyklische Primärstruktur. Eine Kombination aus Mutageneseexperimenten und der MALDI-MS Analyse kompletter Zellpräparationen erweitert die Vorstellung über einen möglichen molekularen Zyklisierungsmechanismus: Im periplasmatischen Raum spaltet die Serinprotease TraF ein 4 Aminosäure langes Peptid vom C-Terminus des TrbCs ab. Es wird postuliert, daß sich das resultierende Acyl-Enzym durch Aminolyse mit der a -Aminogruppe von TrbC in zyklisches TrbC* und in wiederhergestelltes TraF aufspaltet.

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For the first time, this work presents systematic investigations of micro- arrayed sample preparation on MALDI-MS targets using a robotic multi micro- dispenser system. The application of such low-volume handling techniques allow protein identification on the basis of only a few femtomoles of proteolytic peptides that are transferred into the mass spectrometer. This is ~ 1 % of the amount previously needed. In combination with the patented electro-acoustic method (HARP) described here, high density MALDI-MS sample plates can be prepared and analyzed automatically.

Algorithms for the automatic interpretation of MALDI-MS spectra were invented and successfully applied.

The identity of functional proteins, involved in the process of bacterial conjugation, separated by one and two-dimensional gel electrophoresis and membrane blots was determined through mass spectrometric analysis of peptides derived from enzymatic digests. Analysis of primary structure and complex chemical behavior revealed the specific complexation of iron by TraH which is part of the relaxosome. Furthermore, the existence of an N-terminal lipid modification in the entry exclusion mediating TrbK was discovered. Additionally, cleavage of the predicted signal peptide of TrbM was confirmed. In the non-induced state, Lac-I, TraL, TrbG, TrbJ and TrbM were found to be the most prominent plasmid encoded proteins.

MALDI-MS analysis of samples prepared with whole cells were used to determine the mayor component of extra-cellular pilus subunits. The matrix trans-3-indolyl acrylic acid, commonly used for the analysis of synthetic polymers, enabled the sensitive detection of the trbC gene product which was found to be mayor protein component of bacterial pili. In E. coli the RP4 encoded, ribosomally synthesized and multiply processed TrbC is converted into a cyclic protein containing 78 amino acids. The head-to-tail connection of the former N- and C-terminus is realized in form of a peptide bond. At present, the resulting circular protein is the largest cyclo-peptide reported world wide. The gene products, trbC of the analogous plasmid R751 and virB2 of the Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens, consist of a similar circular structure. A combination of mutagenesis experiments and MALDI-MS analyses peek into the cyclization-reaction and fundamentally yield a theoretical model of it?s chemical mechanism: In the periplasmatic space the serine-protease TraF cleaves a four amino acid residue peptide from the C-terminus of TrbC. It is proposed, that the resulting acyl-enzyme reacts via aminolysis involving the a -amine group of the TrbC N-terminus, generating cyclic TrbC* and the restored TraF.

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