Identifizierung eines Indikators für die Verbreitung des Frühsommer- Meningoenzephalitis-Virus und Entwicklung einer RNA-Interferenz-Strategie gegen Frühsommer-Meningoenzephalitis

Abstract

Das Frühsommer-Meningoenzephalitis- (FSME-) Virus verursacht eine der am häufigsten in Asien und Europa vorkommenden Infektionen des zentralen Nervensystems. Eine präventive Impfung schützt vor einer Erkrankung, eine bereits erfolgte Infektion kann jedoch nur symptomatisch behandelt werden. Das Virus gehört zur Familie der Flaviviridae und wird hauptsächlich durch Zecken übertragen. Natürliche Wirtstiere des FSME-Virus sind Nagetiere und andere Kleinsäuger. In Deutschland kommt das Virus vor allem in Süddeutschland vor, breitet sich aber zusehends nach Norden aus. Auch in Brandenburg, welches bisher als FSME-freies Gebiet galt, sind einzelne FSME-Fälle aufgetreten. Jedoch ist die Anzahl der Fälle zu gering, als dass sie Aufschluss über die Verbreitung und damit das humane Infektionsrisiko geben könnten. Diese Dissertation verfolgte zwei Ziele: (a) Zum einen sollten verschiedene Methoden analysiert werden, die zur Untersuchung der Verbreitung des FSME-Virus eingesetzt werden können. (b) Zum anderen sollte ein antivirales Molekül identifiziert und in vitro getestet werden, welches als Grundlage für die Entwicklung eines Medikaments zur Behandlung infizierter Personen dienen kann. (a) Etablierung von Methoden zur Untersuchung der Verteilung des FSME-Virus Es wurde untersucht, ob die FSME-Virusverbreitung in Brandenburg an Hand der Infektionsrate von im Freiland lebenden Wirtstieren ermittelt werden kann und welche Wirtstiere (Zecken oder Nager) sich hierfür eignen. In einem ersten Schritt wurden sensitive und spezifische Methoden (Immunofluoreszenztest, Western Blot, Plaquetest, Neutralisationstest und RT-qPCR mit anschließendem Pyrosequencing) zum Nachweis einer FSME-Virusinfektion am RKI etabliert und evaluiert. Die Analyse der Infektionsrate von im Labor infizierten Ixodes ricinus Zecken und Zecken aus Lettland, einer Region mit hoher FSME- Viruszirkulation, durch RT-qPCR zeigte, dass Zecken wegen ihrer geringen Infektionsrate und ihrem niedrigem Virustiter nur in Regionen mit hoher Viruszirkulation als Risikoindikator in Betracht kommen. Laboruntersuchungen unter kontrollierten Bedingungen wurden eingesetzt, um zu beweisen, dass das Virus zuverlässig in infizierten Feldmäusen (Microtus arvalis) nachweisbar ist, und dass diese Tiere eine persistierende FSME-Virusinfektion ohne Symptome einer Erkrankung entwickeln. Basierend auf diesen Informationen wurden im Freiland gefangene Nager verwendet, um die Verbreitung und Häufigkeit des FSME-Virus in deutschen als FSME-frei geltenden Gebieten und FSME-Risikogebieten zu beurteilen. FSME-Virus-RNA konnte in sechs Nagerspezies nachgewiesen werden: Apodemus agrarius, A. flavicollis, A. sylvaticus, Microtus agrestis, M. arvalis und Myodes glareolus. In Brandenburg wurden ebenfalls Nager positiv auf das Virus getestet. Jedoch war die Infektionsrate der Nager dort niedriger als die in Risikogebieten. Es konnte damit erstmals eindeutig nachgewiesen werden, dass das FSME-Virus in Brandenburg wieder vorkommt. Darüber hinaus belegt die Untersuchung, dass sich Nagetiere auch in Gebieten mit nur geringem FSME-Risiko als Indikator eignen. (b) Entwicklung eines antiviralen Moleküls gegen das FSME-Virus Basierend auf in vivo- Untersuchungen, die belegen, dass siRNAs die Replikation nahe verwandter Flaviviren hemmen, wurden neuartige siRNAs gegen das FSME-Virus entwickelt und in vitro auf ihre Wirksamkeit hin überprüft. Anhand einer in silico- Sequenzanalyse mit allen derzeit verfügbaren FSME-Virus-Gesamtgenom-Sequenzen wurden drei vielversprechende siRNAs ausgewählt und nach Literaturangaben so modifiziert, dass sie an die Sequenzen aller drei humanpathogenen FSME- Virussubtypen binden. In-vitro-Untersuchungen mit serologischen, molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden beweisen, dass die drei ausgewählten siRNAs eine FSME-Virusinfektion konzentrationsabhängig hemmen. In Abhängigkeit vom verwendeten siRNA-Konstrukt und vom verwendeten Virusstamm wurde die Virusreplikation zwischen 60% bis 95% inhibiert und die Viruslast in den Zellen um bis zu 80% reduziert. Das effektivste siRNA- Konstrukt bewirkte eine 50%ige Hemmung der Virusvermehrung (DI50) bei Einsatz von nur 0,001 µg siRNA-Plasmid pro Vertiefung einer 24-Loch-Platte. Für die anderen beiden siRNAs lag die DI50 bei 0,03 µg bzw. 0,6 µg. Der hier verfolgte neue Ansatz bietet daher vielversprechende Möglichkeiten zur Kontrolle des FSME-Virus nach erfolgter Infektion.

Tick-borne encephalitis (TBE) virus causes one of the most important flaviviral infections of the central nervous system in humans in Europe and Asia. The disease is prevented by vaccination but an already existing infection can only be treated symptomatically. The virus belongs to the family Flaviviridae and is mainly transmitted by ticks. Natural host animals are rodents and other small mammals. In Germany, the TBE virus is abundant mainly in southern Germany, but it is spreading rapidly to the north. Recently, single human cases of TBE have been reported for Brandenburg, an area previously considered as TBE-free. So far the number of human cases has been too small to provide information about the distribution and thus risk of infection in humans in Brandenburg. This work has two objectives: (a) On the one hand, methods should be established to investigate the distribution and abundance of the TBE virus in regions of low virus circulation such as Brandenburg. (b) On the other hand, an antiviral molecule should be indentified and tested in vitro, to provide a basis for the development of medication for people already infected. (a) Establishment of methods to investigate the distribution and abundance of TBE virus The objective of this part of the investigation was to assess if the TBE distribution and abundance in Brandenburg could be based on the infection rate of free living host animals. The initial task was to resolve which of the known vectors, ticks or rodents, are suited for the detection of TBE in their natural habitat. In a first step promising methods of high specificity and sensitivity (immunofluorescence, Westernblot, plaque test neutralization test, and RT-qPCR followed by Pyrosequencing) for the detection of TBE virus infection were established at the RKI and evaluated. The analysis of the infection rate of lab infected Ixodes ricinus ticks and ticks from Latvia, a region with high TBE virus circulation, by RT-qPCR revealed that ticks could only be used as sentinels in regions with high virus circulation, due to their low infection rates and virus titers. Laboratory investigations in controlled condition were used to prove, that the virus can be reliably detected in infected Microtus arvalis voles that had developed a persistent TBE infection without any obvious symptoms of disease. Based on this information free-living rodents were used to assess the TBE virus distribution and abundance TBE-free and TBE risk areas in Germany. TBE virus RNA could be identified in six rodent species; Apodemus agrarius, A. flavicollis, A. sylvaticus, Microtus agrestis, M. arvalis and Myodes glareolus. In Brandenburg rodents also were tested positive for the virus, although the rate of infection was lower than the rate in risk areas. Thus, for the first time it could be demonstrated definitively that TBE virus reemerged in Brandenburg. In addition, the study could confirm the status of rodents as sentinels in areas of low TBE risk. (b) Development of an antiviral molecule against TBE In the second part of this study novel siRNAs against the TBE virus were designed and tested in vitro based on in vivo investigations proving that siRNAs are potent inhibitors of the replication of closely related flaviviruses. Three promising siRNAs were chosen based on in silico sequence analysis performed with all TBE virus whole genome sequences currently available. siRNA sequences were modified according to the literature in order to bind to the sequences of all three TBE subtypes. In vitro investigations using serologic, molecular and protein biochemistry methods confirmed the ability of the three siRNAs to inhibit a TBE virus infection in a concentration dependent manner. The inhibition of virus replication by siRNAs ranged between 60% and 95%, the reduction of virus load in the cells was up to 80%, depending on the siRNA and virus strain chosen. A 50% inhibition of virus replication (DI50) could be achieved by only 0.001 µg siRNA plasmid per well of a 24-well plate for the siRNA with the best effect. For the other two siRNAs DI50 was 0.03 µg and 0.6 µg, respectively. This novel approach can constitute a suitable tool for controlling infections by TBE virus.