Rekombinante Expression von Säugetierlipoxygenasen und ortsgerichtete Mutagenese der Sequenzdeterminante für die Reaktionsspezifität

Abstract

Lipoxygenasen gehören zur heterogenen Enzymfamilie der Dioxygenasen und sind in der Lage, durch den Einbau von molekularem Sauerstoff, Hydroperoxide aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu bilden. Diese Reaktion erfolgt unter hoher Regio- und Stereospezifität. Tierische Lipoxygenasen werden dabei entsprechend der Positionspezifität der Arachidonsäureoxygenierung in verschiedene Isoformen (z.B. 12-LOX, 5-LOX) eingeteilt. Die strukturelle Ursache für die Positionsspezifität verschiedener Isoformen ist noch nicht völlig geklärt, doch gibt es Modelle, die Erklärungsmöglichkeiten anbieten. Nach dem Triadenkonzept bilden drei kritische Aminosäuren am Boden der Bindungstasche die entscheidenden Determinanten der Positionsspezifität ausgewählter LOX-Isoformen. Für die 12/15-LOXn von P. pygmaeus und M. mulatta konnte das Triadenkonzept bestätigt werden. Die Enzyme wurden als rekombinante His-Tag-Fusionsproteine in E. coli exprimiert und die potentiellen Sequenzdeterminanten wurden durch ortsgerichtete Mutagenese verändert. Der Einbau von Aminosäuren mit großen Seitenketten ließ die Arachidonsäure weniger tief in die Substratbindungstasche eindringen und bewirkte damit eine 15-Lipoxygenierung. Der Einbau kleinerer Aminosäuren an diesen Stellen induzierte hingegen eine 12-Lipoxygenierung. Obwohl die Triadendeterminanten in der Primärstruktur von einander getrennt sind, beeinflussen sie sich gegenseitig, wodurch ihr funktionelles Zusammenspiel in der 3D-Struktur nachgewiesen wurde. Aminosäuresequenzvergleiche von diversen LOX-Isoformen und Mutageneseuntersuchungen lassen vermuten, dass S-LOXn ein konserviertes Alanin und R-LOXn ein Glycin an einer kritischen Position besitzen. Folglich sollte ein Ala-zu-Gly-Austausch die Stereoselektivität verändern. Für die 12/15-LOXn von P. pygmaeus und M. mulatta konnte dieses Konzept nur zum Teil bestätigt werden. Zwar konnte ein geringer Anstieg an R-konfigurierten Reaktionsprodukten nachgewiesen werden, die Hauptprodukte der Arachidonsäureoxygenierung waren aber weiterhin S-konfiguriert. Um zu überprüfen, welchen Einfluss die N-terminale Domäne auf die Membranbindung hat, wurden Trunkationsmutanten, die nur aus der C-terminalen katalytischen Domäne bestanden exprimiert. Diese Enzyme waren katalytisch aktiv und zeigten eine verringerte Bindung an Biomembranen. Die N-terminale Domäne ist folglich nicht essentiell für die enzymatische Aktivität der 12/15-LOXn von P. pygmaeus und M. mulatta, scheint jedoch die Membranbindung zu verbessern.

Lipoxygenases belong to the heterogeneous enzyme-families of dioxygenases and are able to form hydro peroxids out of unsatturated fatty acids, by insertion of molecular dioxygen. This reaction is performed by a high degree of regional and steric specificity. Animal lipoxygenases are classified by their positional specificity of arachidonic acid oxygenation in different isoforms (i. e. 12-LOX, 5-LOX). The structural reason for the positional specificity of different isoforms is still not clear, but there are existing models, that describe posibilities of explanation. With regard to the triad concept, three critical amino acids at the bottom of the binding pocket are the important determinants for the positional specificity of elected LOX-isoforms. For the 12/15-LOXs of P. pygmaeus and M. mulatta the triad concept could be confirmed. The enzymes were expressed as recombinant his tag fusion proteins in E. coli and the potential sequence determinants were changed by position-controlled mutagenesis. By insertion of amino acids with large side chains, the arachidonic acid could slide less deep into the substrate binding pocket and 15-lipoxgenation was the consequence. The insertion of smaller amino acids on these positions induced a 12-lipoxygenation. Although, the triad determinants are separated in the primary structure, they influence each other, whereby a functional interplay within the 3D-structure could be detected. Amino acid alignments of different LOX-isoforms and mutagenesis studies let suppose, that S-LOXs contain a conserved alanin and R-LOXs a glycin at a critical position. Thus, a ala-to-gly-exchange should change the steric specificity. For the 12/15-LOXs of P. pygmaeus and M. mulatta, this concept could just been partly confirmed. Indeed, there was a little increase of R-configurated reaction products, but the main products of arachidonic acid oxygenation were still S-configurated. To explore the influence of the N-terminal domain for the membrane binding, truncated enzymes, which just consisted of the C-terminal catalytic domain, were expressed. These were catalytic active enzymes and showed a decreased binding to biological membranes. Thus, the N-terminal domain is not essential for the enzymatic activity of 12/15-LOXs of P. pygmaeus and M. mulatta, but increases the binding to membranes.