dc.contributor.author
Vogel, Robert
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:08:19Z
dc.date.available
2012-09-03T09:55:13.786Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7450
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11649
dc.description.abstract
Lipoxygenasen gehören zur heterogenen Enzymfamilie der Dioxygenasen und sind
in der Lage, durch den Einbau von molekularem Sauerstoff, Hydroperoxide aus
mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu bilden. Diese Reaktion erfolgt unter
hoher Regio- und Stereospezifität. Tierische Lipoxygenasen werden dabei
entsprechend der Positionspezifität der Arachidonsäureoxygenierung in
verschiedene Isoformen (z.B. 12-LOX, 5-LOX) eingeteilt. Die strukturelle
Ursache für die Positionsspezifität verschiedener Isoformen ist noch nicht
völlig geklärt, doch gibt es Modelle, die Erklärungsmöglichkeiten anbieten.
Nach dem Triadenkonzept bilden drei kritische Aminosäuren am Boden der
Bindungstasche die entscheidenden Determinanten der Positionsspezifität
ausgewählter LOX-Isoformen. Für die 12/15-LOXn von P. pygmaeus und M. mulatta
konnte das Triadenkonzept bestätigt werden. Die Enzyme wurden als rekombinante
His-Tag-Fusionsproteine in E. coli exprimiert und die potentiellen
Sequenzdeterminanten wurden durch ortsgerichtete Mutagenese verändert. Der
Einbau von Aminosäuren mit großen Seitenketten ließ die Arachidonsäure weniger
tief in die Substratbindungstasche eindringen und bewirkte damit eine
15-Lipoxygenierung. Der Einbau kleinerer Aminosäuren an diesen Stellen
induzierte hingegen eine 12-Lipoxygenierung. Obwohl die Triadendeterminanten
in der Primärstruktur von einander getrennt sind, beeinflussen sie sich
gegenseitig, wodurch ihr funktionelles Zusammenspiel in der 3D-Struktur
nachgewiesen wurde. Aminosäuresequenzvergleiche von diversen LOX-Isoformen und
Mutageneseuntersuchungen lassen vermuten, dass S-LOXn ein konserviertes Alanin
und R-LOXn ein Glycin an einer kritischen Position besitzen. Folglich sollte
ein Ala-zu-Gly-Austausch die Stereoselektivität verändern. Für die 12/15-LOXn
von P. pygmaeus und M. mulatta konnte dieses Konzept nur zum Teil bestätigt
werden. Zwar konnte ein geringer Anstieg an R-konfigurierten
Reaktionsprodukten nachgewiesen werden, die Hauptprodukte der
Arachidonsäureoxygenierung waren aber weiterhin S-konfiguriert. Um zu
überprüfen, welchen Einfluss die N-terminale Domäne auf die Membranbindung
hat, wurden Trunkationsmutanten, die nur aus der C-terminalen katalytischen
Domäne bestanden exprimiert. Diese Enzyme waren katalytisch aktiv und zeigten
eine verringerte Bindung an Biomembranen. Die N-terminale Domäne ist folglich
nicht essentiell für die enzymatische Aktivität der 12/15-LOXn von P. pygmaeus
und M. mulatta, scheint jedoch die Membranbindung zu verbessern.
de
dc.description.abstract
Lipoxygenases belong to the heterogeneous enzyme-families of dioxygenases and
are able to form hydro peroxids out of unsatturated fatty acids, by insertion
of molecular dioxygen. This reaction is performed by a high degree of regional
and steric specificity. Animal lipoxygenases are classified by their
positional specificity of arachidonic acid oxygenation in different isoforms
(i. e. 12-LOX, 5-LOX). The structural reason for the positional specificity of
different isoforms is still not clear, but there are existing models, that
describe posibilities of explanation. With regard to the triad concept, three
critical amino acids at the bottom of the binding pocket are the important
determinants for the positional specificity of elected LOX-isoforms. For the
12/15-LOXs of P. pygmaeus and M. mulatta the triad concept could be confirmed.
The enzymes were expressed as recombinant his tag fusion proteins in E. coli
and the potential sequence determinants were changed by position-controlled
mutagenesis. By insertion of amino acids with large side chains, the
arachidonic acid could slide less deep into the substrate binding pocket and
15-lipoxgenation was the consequence. The insertion of smaller amino acids on
these positions induced a 12-lipoxygenation. Although, the triad determinants
are separated in the primary structure, they influence each other, whereby a
functional interplay within the 3D-structure could be detected. Amino acid
alignments of different LOX-isoforms and mutagenesis studies let suppose, that
S-LOXs contain a conserved alanin and R-LOXs a glycin at a critical position.
Thus, a ala-to-gly-exchange should change the steric specificity. For the
12/15-LOXs of P. pygmaeus and M. mulatta, this concept could just been partly
confirmed. Indeed, there was a little increase of R-configurated reaction
products, but the main products of arachidonic acid oxygenation were still
S-configurated. To explore the influence of the N-terminal domain for the
membrane binding, truncated enzymes, which just consisted of the C-terminal
catalytic domain, were expressed. These were catalytic active enzymes and
showed a decreased binding to biological membranes. Thus, the N-terminal
domain is not essential for the enzymatic activity of 12/15-LOXs of P.
pygmaeus and M. mulatta, but increases the binding to membranes.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
sequence determinants
dc.subject
reaction specificity
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Rekombinante Expression von Säugetierlipoxygenasen und ortsgerichtete
Mutagenese der Sequenzdeterminante für die Reaktionsspezifität
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Hartmut Kühn
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ivo Feußner
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Claus Wasternack
dc.date.accepted
2012-09-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000038481-6
dc.title.translated
Recombinant expression of mammalian lipoxygenases and position-controlled
mutagenesis of the sequence determinants for the reaction specificity
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000038481
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011628
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access