Neuroprotektion durch den PPARδ‑Agonisten SAR145 in einem murinen Modell des ischämischen Schlaganfalls

Abstract

Ein besseres Verständnis der Pathophysiologie des Schlaganfalls hat die Modulation der postischämischen Inflammation als Ansatzpunkt für eine neuroprotektive Therapie nach zerebralen ischämischen Ereignissen in den Fokus gerückt. Berichte über die antiinflammatorischen Eigenschaften der peroxisome proliferator‑activated receptor (PPAR)‑Familie mit den Subtypen α, γ und δ gaben Anlass zur Hoffnung, dass Agonisten dieser Rezeptoren neuroprotektive Eigenschaften besitzen. Agonisten des im Gehirn prädominanten Rezeptorsubtyps PPARδ waren jedoch lange Zeit nicht verfügbar. Erst in den letzten Jahren wurde die neuroprotektive Wirksamkeit einer intrathekalen Vorbehandlung mit PPARδ‑Agonisten untersucht. In in-vivo- und in-vitro-Modellen des ischämischen Schlaganfalls wurde in der vorliegenden Arbeit nun erstmals der neuartige PPARδ‑Agonist SAR145 untersucht, der auch bei oraler Gabe eine hohe zerebrale Bioverfügbarkeit zeigt. Im transienten proximalen middle cerebral artery occlusion (MCAo)‑Modell des ischämischen Schlaganfalls wurden dazu an C57Bl/6 Mäusen in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) im ersten Schritt die wirksamste Dosis und das effektive Zeitfenster für die Behandlung mit SAR145 bestimmt. Um eine nicht PPARδ‑spezifische neuroprotektive Wirkung von SAR145 auszuschließen, wurde die effektivste Dosis/Behandlungszeitpunktkombination zudem an PPARδ‑Knock‑out (KO)‑Tieren getestet. Im letzten Schritt wurde mit einer Verhaltenstestbatterie der Einfluss von SAR145 auf das funktionelle Defizit nach MCAo über einen Zeitraum von 28 Tagen analysiert. Zusätzlich wurde der Effekt von SAR145 auf die Aktivierung von Mikroglia und Endothelzellen durch inflammatorische Stimuli in vitro untersucht. In drei unabhängigen Gruppen führte die Behandlung mit 10 mg SAR145 pro Kilogramm (kg) Körpergewicht (KG) zum Zeitpunkt der Reperfusion im Mittel zu einer Reduktion der Infarktgröße um im Vergleich zu den Vehikelgruppen. Dieser Effekt war jedoch in keiner der Subgruppen statistisch signifikant. PPARδ‑Knock‑out‑Tiere zeigten im Vergleich zu Wildtyp‑Tieren eine signifikant höhere Mortalität nach MCAo. Tiere der Knock‑out‑Verumgruppe zeigten im Vergleich zu Tieren der Knock‑out‑Vehikelgruppe im Mittel keine kleineren Infarkte. In der Analyse des funktionellen Endergebnisses zeigte sich keine signifikante Neuroprotektion durch eine Behandlung mit SAR145. In vitro kam es bei Behandlung mit SAR145 zu einer signifikanten Reduktion der Aktivierung von Mikroglia und Endothelzellen durch einen inflammatorischen Stimulus. Insgesamt zeichnete sich das Bild einer allenfalls moderaten neuroprotektiven Wirkung von SAR145, die jedoch mit den verwendeten Methoden in vivo nicht zu belegen war. Die vorliegende Arbeit steht damit im Widerspruch zu bisherigen Publikationen, die eine deutliche Neuroprotektion durch eine Behandlung mit PPARδ‑Agonisten berichteten. Neben Unterschieden im experimentellen Design und den verwendeten Substanzen könnten auch Unterschiede in der Studienqualität, das sogenannte Proteus‑Phänomen und publication bias zu einer scheinbaren Vergrößerung der bisher berichteten Effektgrößen beigetragen haben. Aufgrund der geringen Anzahl bisher veröffentlichter Studien zu PPARδ-Agonisten in Modellen des ischämischen Schlaganfalls lässt sich dies jedoch mit den bislang zur Verfügung stehenden statistischen Methoden nicht eindeutig belegen.

Better understanding of the pathophysiology of ischemic stroke led to the insight that neuronal injury after stroke progresses for days to weeks after onset of symptoms. One of the key players in this process is an ischemia induced inflammatory reaction in the affected area. Reports about the important role of the nuclear Peroxisome Proliferator Activated Receptor (PPAR)-family in regulating inflammatory signaling fostered hope to use PPAR agonists as a neuroprotective therapy even in a wider time window. The PPAR- family consists of the subtypes α, γ and δ, with subtype δ being the most abundant one in the brain. PPARδ agonists however have only become available rather recently. As yet there is little knowledge about the neuroprotective potency of pharmacological PPARδ activation after an ischemic event. We tested the novel orally administered PPARδ agonist SAR145 in the in vivo transient proximal middle cerebral artery occlusion (MCAo) filament model of ischemic stroke and the effect of SAR145 treatment on microglial and endothelial activation in vitro. In accordance with the stroke academic industry roundtable (STAIR) recommendations we first established the most effective dose and time point after reperfusion in C57Bl/6 mice using histological papanicolaou staining to determine infarct sizes. To rule out non-specific neuroprotective effects we then used PPARδ knockout mice to test the neuroprotective potency of SAR145 in the absence of PPARδ. The effect of SAR145 on the functional longer-term outcome was further evaluated using a battery of behavioural tests up to four weeks after MCAo. Three independent groups treated with 10 mg/kg bodyweight SAR145 directly after reperfusion showed a consistent mean reduction in infarct size of 18 ±10 % compared to vehicle treated groups. However, in rigorous statistical testing these effects were not significant. PPARδ knockout mice showed a significantly higher mortality after MCAo and there was no reduction in infarct size observed in the verum treated knockout group. The assessment of functional longer-term outcome yielded no significant neuroprotection by SAR145 treatment. In vitro activation of microglia and endothelial cells by an inflammatory stimulus was significantly reduced by treatment with SAR145. In this study we could not confirm prior reports of strong neuroprotection yielded by treatment with PPARδ agonists. This could be due to differences in the experimental design or the used substances but may also be explained by differences in study quality, the “proteus phenomenon” or publication bias. However, as to date only very few studies on PPARδ agonists in models of cerebral ischemia are available, the influence of these factors could not yet be statistically proven.