Mucoadhesive Nanocarriers for Nasal Delivery of Vaccines

Abstract

Most of the vaccines are administered via a parenteral route. This causes pain and local irritation reactions in many individuals and thus leading to inconveniences for patients. From the past few years, the scientific community has placed emphasis on formulating vaccines for the oral or nasal route. In recent years, along with various formulation strategies, nanoparticles were explored as potential vaccine delivery carriers with little success. The objective of the present work was to prepare nanoparticles which will improve nasal uptake of antigen and trigger the initial cascade of the immune response. Novel polymeric nanoparticles with additional adjuvant effect were developed by combining a mucoadhesive polymer and an immune stimulant polymer. Different polyanionic mucoadhesive polymers like sodium alginate (ALG), sodium carboxymethylcellulose (CMC), sodium hyaluronate (HA) and sodium pectinate (PCT) were screened to obtain stable nanoparticles with low particle size and high encapsulation of model protein (BSA). Diethylaminoethyldextran (DEAE), an immune stimulant polymer, was incorporated into the nanoparticles to achieve immune modulation. ALG as a mucoadhesive polymer produced nanoparticles with maximum encapsulation of BSA (20%), the smallest particle size (~100 nm), lowest polydispersity index (PDI) and optimal zeta potential (-34.7 mV). To achieve higher BSA encapsulation, the nanoparticles were further optimized with respect to pH of BSA solution, BSA loading and addition rate. The FTIR analysis indicated that ionic interactions were predominant in the ALG-BSA- DEAE complex. The gel electrophoresis (SDS-PAGE) confirmed the structural integrity while CD spectroscopic analysis confirmed the conformational stability of BSA. The strong ionic interactions between BSA, ALG and DEAE resulted in a controlled release of BSA from nanoparticles (~16% released in 8 hours). In vitro mucoadhesion studies performed by measuring detachment force with a texture analyzer and changes in net surface charge (zeta potential) of mucin particles by Zetasizer instrument confirmed the substantial mucoadhesive potential of the BSA-loaded nanoparticles. Furthermore, in vitro cytotoxicity studies on human macrophages (THP 1 cell line) confirmed the non-toxic nature of the nanoparticles. To evaluate the efficacy of Tetanus toxoid (TT) loaded mucoadhesive polymeric nanoparticles, an in vivo immunization study was performed on Balb/c mice. The TT specific serum IgG antibody levels (humoral response) were significantly higher for TT nanoparticles and marketed formulation treatment groups as compared to control group. The secretion of IFN-γ and IL-2 cytokines after restimulation of spleen cells was significantly higher for TT nanoparticles, blank nanoparticles and marketed formulation treatment groups, indicating strong cellular response. To study the mechanism of immune stimulation by nanoparticles, Ovalbumin (OVA) loaded polymeric nanoparticles were prepared by optimized method. In vivo immunization study was performed on female C57BL/6 mice followed by immunoglobulin analysis in serum samples. Flow cytometric analysis of various cell populations in blood and spleen was performed along with in vitro splenocyte stimulation assays to evaluate the release of specific cytokines. Delivery of OVA loaded mucoadhesive nanoparticles produced higher serum IgG levels. Populations of monocytes (CD11b+), dendritic cells (CD11c+), B-lymphocytes (B220+) was significantly increased after nasal delivery of OVA nanoparticles as compared to nasal delivery of adsorbed OVA. Th1, Th2 and Th17 type cytokine (IFN-γ, IL-6, IL-10 and IL-17a) levels in OVA nanoparticle group was significantly increased after in vitro stimulation with antigen (OVA). Thus, all important components of the immune system were stimulated when antigen was loaded in nanoparticles and delivered by nasal route. These key achievements can be translated into a promising, cost-effective vaccine delivery system for the nasal route.

Die meisten Impfungen werden parenteral appliziert. Dies verursacht bei manchen Personen Schmerzen und lokale Irritationen und führt somit zu Unannehmlichkeiten für die Patienten. Seit ein paar Jahren liegt der Schwerpunkt der wissenschaftlichen Forschung auf der Formulierung von Impfungen für die orale oder nasale Anwendung. In den letzten Jahren, zusammen mit verschiedenen Fomulierungsstrategien, wurden Nanopartikel als potentielle Dareichungsform für Impfstoffe getestet, jedoch mit wenig Erfolg. Das Ziel dieser Arbeit war es, Nanopartikel zu herzustellen, welche die nasale Aufnahme des Antigens verbessern und die initiale Kaskade der Immunantwort triggern. Neuartige Polymernanopartikel mit zusätzlichem Adjuvantien-Effekt wurden durch das Kombinieren eines mukoadhäsiven Polymers und eines immunstimulierenden Polymers entwickelt. Verschiedene polyanionische, mukoadhäsive Polymere wie Natriumalginat (ALG), Natrium-Carboxymethylcellulose (CMC), Natriumhyaluronat (HA) und Natriumpektinat (PCT) wurden getestet, um stabile Nanopartikel mit kleiner Partikelgröße und hoher Modellprotein (BSA)-Einschlusseffizienz zu erreichen. Diethylaminoethyldextran (DEAE), ein immunstimulierendes Polymer wurde in die Nanopartikel eingearbeitet um eine Immunreaktion zu erzielen. ALG als mukoadäsives Polymer führte zu Nanopartikeln mit der höchsten BSA- Einschlusseffizienz, der kleinsten Partikelgröße (~100 nm), dem niedrigstem Polydispersitätsindex (PDI) und optimalem Zeta-Potenzial (-34.7 mV). Um eine höhere BSA-Einschlusseffizienz zu erreichen, wurden die Nanopartikel bezüglich dem pH der BSA-Lösung, der BSA-Beladung und der Zugabegeschwindigkeit weiter optimiert. Die FTIR-Untersuchung deutete darauf hin, dass die ionischen Interaktionen im ALG-BSA-DEAE-Komplex prädominant waren. Die Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestätigte die strukturelle Intaktheit während die Stabilität der Konformation von BSA durch die CD-Spektroskopie nachgewiesen wurde. Die starken Interaktionen zwischen BSA, ALG und DEAE führten aus den Nanopartikeln zu einer kontrollierten Freisetzung von BSA (~16% freigesetzt nach 8 Stunden). Bei in vitro Mukoadhäsionstests wurde die Ablösekraft mit Hilfe eines Texture Analyzers gemessen, sowie die Veränderung der Netto-Oberflächenladung (Zeta- Potenzial) von Muzin-Partikeln mit einem Zetasizer-Apparat bestimmt. Die Tests bestätigten das beachtliche mukoadhäsive Potenzial der mit BSA beladenen Nanopartikel. Des Weiteren zeigten in vitro Zytotoxizitätsstudien mit humanen Makrophagen (Zelllinie THP 1), dass die Nanopartikel nicht toxisch waren. Um die Wirksamkeit von mit Tetanustoxoid (TT) beladenen mukoadhäsiven Polymernanopartikeln zu untersuchen, wurde eine in vivo-Immunisierungsstudie mit Balb/c-Mäusen durchgeführt. Die Gesamtkonzentrationen der TT-spezifischen IgG Antikörper (humorale Immunantwort) im Serum waren für TT Nanopartikel und markierte Formulierung-Behandlungsgruppen im Vergleich zur Kontroll-Gruppe signifikant höher. Die Sekretion von IFN-γ und IL-2 Zytokine nach Restimulation von Milzzellen war signifikant höher für TT-Nanopartikel. Mit Placebo-Nanopartikeln und markierter Formulierung behandelten Gruppen haben auf eine starke zelluläre Antwort hingewiesen. Um den Mechanismus der Immunstimulierung durch Nanopartikel zu untersuchen, mit Ovalbumin (OVA) geladene Polymernanopartikeln wurden durch optimierte Verfahren hergestellt. In vivo Immunisierungsstudie wurde an weiblichen C57BL / 6-Mäuse durchgeführt gefolgt von Immunglobulin-Analyse in Serumproben. Die durchflusszytometrische Analyse der verschiedenen Zellpopulationen in Blut und Milz wurde durchgeführt, zusammen mit in vitro Splenozyten Stimulation Assays um die Freisetzung bestimmter Zytokine zu bewerten. Mit OVA geladenen mucoadhäsiven Nanopartikeln produzierten höhere Serum IgG-Spiegel. Die Populationen von Monozyten (CD11b+), dendritische Zellen (CD11c+), B-Lymphozyten (B220+) wurde nach nasale Verabreichung von OVA-Nanopartikel deutlich erhöht im Vergleich zu einer nasaler Verabreichung von adsorbiertem OVA. Th1, Th2 und Th17 Typ Zytokin (IFN-γ, IL-6, IL-10 und IL-17A) -Spiegel in der OVA Nanopartikel Gruppe wurde nach in vitro Stimulation mit Antigen (OVA) signifikant erhöht. Somit wurden alle wichtigen Komponenten des Immunsystems stimuliert, wenn Antigen war in Nanopartikeln geladen und nasal geliefert. Diese Erfolge können Anwendung finden als verheißungsvolles, kosteneffektives Impfstoff- Darreichungssystem zur nasalen Applikation.