Entwicklung von Arzneiformen zur dermalen und ophthalmologischen Applikation schwerlöslicher Immunsuppressiva

Abstract

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die schwerlöslichen Immunsuppressiva Ciclosporin und Mycophenolat Mofetil in gut verträglichen Lipidvesikeln mit Ceramid IIIB (CER), Diacylglyceriden (DAG) oder Phosphatidylcholin (PC) als Hauptkomponenten eingearbeitet, um eine topische Therapie chronisch entzündlicher Hauterkrankungen zu ermöglichen. Die entwickelten Formulierungen erhielten die Bezeichnungen CER(-), CER(+), CER(I), DAG(B), DAG(I), PC(-) und PC(+), wobei (+) oder (-) das Vorzeichen des Zetapotenzials symbolisieren. B oder I steht für die hydrophilen Emulgatoren Brij® 58 oder Imwitor® 375. Die hergestellten Vesikel waren unilamellar, hatten mittlere Teilchendurchmesser zwischen 74 und 235 nm und Membrandicken zwischen 3,5 und 4,5 nm. Ausreichende Löslichkeiten wurden für Ciclosporin mit DAG und CER Vesikeln, für Mycophenolat Mofetil in PC und CER Vesikeln erzielt. Die Löslichkeit in den günstigsten Formulierungen betrug 6,6 7,4 mg/ml für Ciclosporin und 8,9 9,8 mg/ml für Mycophenolat Mofetil. In DSC Scans zeigten Formulierungen mit Imwitor® 375 keine Peaks, was Hinweise auf den flüssigkristallinen Aggregatzustand dieser Vesikel liefert. In Formulierungen mit Brij® 58 kann es bei Temperaturen oberhalb von 70 °C zur Membranzerstörung kommen, was eine eindeutige Detektion von DSC Peaks erschwert. Mit Hilfe der Protonenresonanzspektroskopie (1H NMR) liessen sich die fünf untersuchten Zubereitungen in die folgende Reihenfolge steigender Mikroviskosität einordnen: DAG(I) <DAG(B)<CER(I)<CER(-)<CER(+). In quantitativen Messungen mit der Elekronen Spin Resonanz (ESR) Spektroskopie zeigten die fluiden DAG Vesikel Mikroviskositäten von 39,84 - 43,48 mPa s, PC(-) und CER(I) lagen bei 71,02 78,27 mPa s, während CER(-), PC(+) und CER(+) mit jeweils 267,17 ± 68,2, 538,08 ± 184,2 und 565,84 ± 163,0 mPa s deutlich hochviskoser waren. Im Vergleich dazu haben einfache Liposomen aus natürlichem Sojaphosphatidylcholin eine Mikroviskosität von 49,8 ± 2,5 mPa s, während für gemischte Sojaphosphatidylcholin/ Natriumcholatvesikel (sogenannte Transfersomen®) erniedrigte Mikroviskositäten von 28,8 ± 2,5 mPa s beobachtet wurden. Durch Verwendung eines Mehrschichtmodells mit lipophilen Akzeptormembranen wurde eine steigende Freisetzungsgeschwindigkeit von Ciclosporin und Mycophenolat Mofetil für CER Vesikel im Vergleich zu PC und DAG Vesikeln gemessen. Im zweiten Teil der Arbeit erwies sich die Entwicklung von Augentropfen mit dem nahezu wasserunlöslichen mTOR Inhibitor Sirolimus und seinem etwas hydrophileren Derivat Everolimus als große Herausforderung. Eine Mikroemulsion konnte erfolgreich genutzt werden, um Sirolimus und Everolimus in einer ophthalmologisch anzustrebenden Konzentration von 1 mg/ml zu lösen. Sirolimus kann die isolierte Schweinecornea nur sehr langsam permeieren. Dieser Wirkstoff ist daher nur zur Behandlung von Erkrankungen im externen Augenbereich verwendbar, z. B. bei trockener Bindehautentzündung, allergischer Bindehautentzündung oder atopischer Lidrandentzündung. In einem experimentellen Keratoplastikmodell konnten durch topische Applikation von Mikroemulsionen mit 0,025 oder 0,05 proz. Everolimus die mittleren Transplantatüberlebenszeiten signifikant auf 16,4 ± 2,3 d und 21,4 ± 7,0 d gesteigert werden, verglichen mit 13,3 ± 1,7 d in der vehikelbehandelten Kontrollgruppe. Es wurden Wundheilungsstörungen beobachtet, die wahrscheinlich auf eine Hemmung der Zellproliferation zurückführbar sind.

In the first part of the present study the well compliant lipid vesicles CER(-), CER(+), CER(I), DAG(B), DAG(I), PC(-), and PC(+) have been developed using ceramide IIIB (CER), diacylglycerides (DAG), or phosphatidylcholine (PC) as main lipids for a topical treatment of chronic inflammatory dermatoses with the poorly soluble immunosuppressants ciclosporine and mycophenolate mofetil (MMF). B and I indicate the used hydrophilic emulsifiers Brij® 58 or Imwitor® 375 whereas (+) or (-) symbolise the positive or negative zeta potential. Adequate solubilities were obtained with lipid vesicles containing DAG or CER for ciclosporine, and PC or CER for MMF. The manufactured vesicles were unilamellar, had average diameters between 74 and 235 nm, as well as membrane thicknesses between 3.5 and 4.5 nm. The solubility of ciclosporine and MMF in the most favorable formulations was 6.6-7.4 mg/mL and 8.9-9.8 mg/mL, respectively. Differential scanning calorimetry (DSC) scans indicate fluid membranes in formulations with Imwitor® 375 as hydrophilic surfactant. Membrane destructions could be observed in formulations containing Brij® 58 at temperatures >70 °C which complicate a purposeful DSC analysis. The proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR) was used to investigate the membrane characteristics in DAG and CER vesicles. The microviscosities in the membranes increased in the order DAG(I)<DAG(B)<CER(I)<CER(-)<CER(+). In order to quantify the microviscosity in vesicle membranes the electron spin resonance (ESR) was used. The fluid DAG vesicles had a microviscosity of 39.84 43.48 mPa s, PC(-) and CER(I) were determined with 71.02 78.27 mPa s, whereas CER(-), PC(+) and CER(+) were much more rigid with 267.17 ± 68.2, 538.08 ± 184.2, and 565.84 ± 163.0 mPa s, respectively. Liposomes containing natural soyphosphatidylcholine have a microviscosity of 49.8 ± 2.5 mPa s, and mixed soyphosphatidylcholine/ sodium cholatevesicles (so called Transfersomes®) had decreased microviscosities of 28.8 ± 2.5 mPa s. A multilayer model with lipophilic acceptor membranes was used to determine the in vitro drug release due to the poor aqueous solubility of ciclosporine and MMF. An increased release of both drugs was detected for rigid CER vesicles in comparison to the other formulations, especially to the very fluid DAG vesicles. The second part of the present paper shows the development of eye drops with sirolimus or everolimus. A microemulsion is a suitable vehicle to prepare eye drops with sufficiently high concentrations of 1 mg/mL in a formulation with acceptable tolerance and satisfactory stability over 12 months. Sirolimus can not permeate the isolated pig cornea. As a consequence the present sirolimus eye drops might be a promising therapeutic tool for immunomodulatory treatment of ocular surface disorders like keratoconjunctivitis sicca, vernal conjunctivitis, or atopical blepharitis. The topical administration of the microemulsion with everolimus was examined for a prevention of corneal allograft rejections in an experimental rat model. Local administration of 0.05 % or 0.025 % everolimus showed significantly prolonged mean survival times of corneal grafts (21.4 ± 7.0 days, and 16.4 ± 2.3 days, respectively) in comparison to the vehicle control group (13.3 ± 1.7 days). The mean survival time was reduced by a topical administration of 0.1 % everolimus. This observation was associated with reduced lesion healing which was probably induced by an inhibition of cell proliferation.