Relationship between previous and concurrent aerobic bacteriological findings in the uterus and the prevalence of puerperal diseases in dairy cows

Abstract

Puerperal metritis, clinical endometritis and subclinical endometritis are highly present in dairy cows. To prevent or treat those diseases in an appropriate way the knowledge of risk factors and coherences for their appearance is important. Various metabolic parameters were identified to be associated with puerperal diseases and bacteria could be isolated from the uterus of cows with clinical signs of illness. The uterine lumen of postpartum dairy cows is commonly contaminated with different bacterial species after parturition. Cows who fail to eliminate the pathogenic species often develop puerperal metritis or later in the puerperium clinical endometritis. Bacterial uterine infections have been shown to negatively affect ovarian function and fertility. The objective of my first study was to investigate relationships between Escherichia coli , Trueperella pyogenes, alpha-hemolytic Streptococci, and coagulase negative Staphylococci and their presence and effect on each other and uterine infections 2 weeks later. Therefore bacteriological samples were collected at 10 ± 1 and 24 ± 1 DIM from the uterine lumen using a cytobrush. Vaginal examination was performed by vaginoscopy. The vaginal discharge was assigned according to its distribution of pus to identify cows with puerperal metritis (10 ± 1 DIM) or clinical endometritis (24 ± 1 DIM). Bacteria were identified on the basis of the characteristics of the colony and standard tests (e.g. Gram stain, morphology, hemolysis, biochemical profile) and bacterial growth quantified on a 4-point scale. Cows infected with E. coli or T. pyogenes at 10 ± 1 DIM had a higher risk for an infection with the same bacterial species at 24 ± 1 DIM [E. coli relative risk (RR) = 3.7; T. pyogenes RR = 2.9]. Cows infected with T. pyogenes also had a greater risk to be diagnosed with abnormal vaginal discharge at first (RR = 2.4, P < 0.001) and second (RR = 2.4, P < 0.001) examination. In terms of risk factor for clinical endometritis, the risk of being diagnosed with abnormal vaginal discharge at 24 ± 1 DIM increased in cows positive for E. coli (RR = 1.7) or T. pyogenes (RR = 1.7) at 10 ± 1 DIM. These cows also had more days to pregnancy (T. pyogenes 139 d, P < 0.05) and more cows were culled (E. coli 15.8%, P < 0.05) or had significant more days to first artificial insemination (E. coli 70 d, P < 0.001). These results demonstrate that cows infected with or T. pyogenes are prone to persistent infections 2 weeks later and also had higher risks to develop clinical endometritis. Infections with AHS only increased the risk for abnormal vaginal discharge which warrants further research of their role in the uterus. CNS did not affect the infection with the same or other bacterial species 2 weeks later, as well as AHS, or influenced the vaginal discharge. Recent studies describing uterine bacterial contents have used guarded cotton swabs or biopsy method. The cytobrush technique I used to collect bacteriological samples was originally evaluated in human medicine to collect cell material from the vagina or the uterus to diagnose inflammations by means of polymorph nuclear neutrophil leucocytes. The technique has been validated for cows to diagnose the SCE. Several recent studies have utilized the CB to harvest endometrial cells and bacteria from uterine lumen simultaneously, however, it never was validated for it. Therefore my second objectives of the first study were to evaluate the cytobrush for the collection of bacteria from the uterus and to test the agreement of bacteriological findings between 3 different laboratories. Uterine discharge was aspirated with a disposable catheter from 68 cows at 10 ± 1 DIM and transferred into a sterile plastic tube. From these tubes 1 CS and 1 CB each were sent to 3 different laboratories and the positive or negative findings of E. coli, T. pyogenes, AHS and CNS were compared. One laboratory received a second CS to test the intraassay repeatability. The agreement of bacteriological results of the laboratories were significant for laboratory A + B and A + C for each sampling method, CB and CS (A + B: CB = 86%, CS = 92%; A + C: CB = 82%, CS = 86%). The highest agreement considering the bacterial species was found for E. coli (A + B: CB = 89.7%, CS = 98.5%; A + C: CB = 82.4%, CS = 88.2%). The interlaboratory agreements between CB and CS were significant for each of the 3 laboratories (A = 92%; B = 97%; C = 93%) as was intralaboratory repeatability for laboratory A. Due to a missing gold standard it is impossible to prove which results are more accurate. But these results consider the cytobrush a valuable technique to generate information about infectious and inflammatory properties in the endometrium with a single sample. The subclinical endometritis has a high prevalence in dairy cows but the approaches to diagnose the disease showed a wide variety of cut points for the amount of percent PMNL and sampling time. SCE was proved to have a severe negative impact on fertility. Recent studies identified a low body condition score, hyperketonemia or increased haptoglobin concentrations as risk factors for their development. My objective of the second study was first, to determine the relationship between aerobic bacteria in the uterus of healthy animals and PMNL in the early postpartum period. Second I compared 2 classification schemes for the diagnosis of SCE. Cytological and bacteriological samples were taken from 149 cows at 10 ± 1 and 24 ± 1 DIM. Cows were included into the study it they were diagnosed with no or clear vaginal mucus at the second examination. Additionally, 131 cows at 21 to 27 DIM without signs of clinical endometritis were sampled. The cytobrush technique was used for sample collection and vaginal examination was performed by vaginoscopy. The cut points for PMNL in the uterus were set at 5, 10 and 18%. Cows infected with AHS at 10 ± 1 DIM had significant (P = 0.006) higher percent PMNL, more days to pregnancy (Hazard Ratio = 1.7, P = 0.038) and decreased odds of pregnancy by 250 DIM (Odds Ratio = 0.4, P = 0.022) compared to cows not infected with AHS. Anaerobic bacteria were not isolated in this study so their effect cannot be excluded. However, in another study Fusobacterium necrophorum and Prevotella melaninogenica , 2 well known uterine pathogens, did not show any association with percent PMNL at concurrent infection in which enhances the results for AHS as risk factor for SCE. Also T. pyogenes increased the odds about 5.1 to diagnose the same cow with more than 18% PMNL 2 weeks later but without abnormal vaginal discharge. The impairment of the endometrium induced by T. pyogenes and stimulus for the immune system could explain the long period cows need to cure the infection and the persistence of PMNL in the uterus. AHS, T. pyogenes , E. coli or CNS isolated at 24 ± 1 DIM did not affect the distribution of percent PMNL at the same examination day. For the comparison of different cut points the reproductive performance outcomes were compared when the same cows (24 ± 1 and 21 to 27 DIM) were arranged in 2 different schemes: PMNL1 (< 5, 5 – 18, > 18% PMNL) and PMNL2 (< 10, 10 – 18, > 18% PMNL). Reproductive performance outcomes were numerically better in the intermediate groups (5 – 18 and 10 – 18%) compared to cows with low (< 5/ < 10%) or high (> 18%) PMNL. Considering parity reproductive performance parameters differed significantly. In primiparous cows days to pregnancy were lower in cows of each intermediate group (5 -18: 68 d, P = 0.017; 10 – 18: 70 d, P = 0.039) compared to cows with > 18% PMNL (144.5 d). In multiparous cows the reproductive performance parameters did not differ significantly neither in PMNL1 nor in PMNL2. These results demonstrate that the cut point of 18% PMNL had a high diagnostic value, at least for primiparous cows, at 21 to 27 DIM to identify cows with SCE. In conclusion, the results of the two trials showed that previous infections with E. coli or T. pyogenes are essential risk factors for CE, whereas both negatively affected reproductive performance parameters and E. coli seemed to pave the way for T. pyogenes. The SCE was shown to be affected by previous infections with T. pyogenes or AHS. Additionally, cows infected with AHS had longer days to pregnancy intervals and showed a decrease in the number of cows pregnant. Hence, more research is needed to prove the pathogenic potential of AHS including anaerobic bacteria. The bacteriological results of different laboratories showed high agreements between CB and CS. The CB validated for the collection of cells from the uterus is also useful for bacterial analysis.

Puerperale Erkrankungen beim Rind wie die puerperale Metritis, klinische Endometritis und subklinische Endometritis treten sehr häufig in deutschen Milchleistungsbetrieben auf. Um diese Erkrankungen zu vermeiden oder zielgerichteter behandeln zu können ist die Erforschung ihrer Risikofaktoren und Zusammenhänge ihres Auftretens essentiell. Verschiedene metabolische Parameter konnten bereits als Risikofaktoren für puerperale Erkrankungen identifiziert werden. Auch wurden verschiedene Bakterien aus dem Uterus von klinisch erkrankten Kühen isoliert und untersucht. Der Uterus von Milchrindern ist nach der Abkalbung üblicherweise mit Bakterien besiedelt. Wenn das Immunsystem nicht in der Lage ist pathogene Keime zu eliminieren, kann eine puerperale Metritis oder später im Puerperium eine klinische Endometritis entstehen. Bakterielle Infektionen haben einen negativen Einfluss auf die Ovarfunktion sowie die Fertilität. Daraus ergab sich als Ziel der ersten Studie, den Zusammenhang zwischen der Präsenz verschiedener Keime des Uterus (bekannt pathogen: Escherichia coli, Trueperella pyogenes; Opportunisten: alpha-haemolysierende Streptokokken, coagulase negative Staphylokokken) und bakteriellen Funden 2 Wochen später herzustellen und den Einfluss auf die Entstehung von Uteruserkrankungen zu untersuchen. Für die Entnahme bakterieller Proben aus dem Uterus wurden die Studientiere an Tag 10 ± 1 und 24 ± 1 postpartum mittels Cytobrush beprobt. Der vaginale Ausfluss wurde mit einem Vaginoskop untersucht, um Tiere mit einer puerperalen Metritis (10 ± 1) oder klinischen Endometritis (24 ± 1) zu identifizieren. Die Anzahl der Koloniebildenden Einheiten auf den Blutagarplatten wurde mittels einer 4 Punkte Skala bewertet. Die Studie ergab, dass Kühe bei denen E. coli oder T. pyogenes an Tag 10 ± 1 postpartum (pp) isoliert werden konnte ein erhöhtes Risiko aufwiesen, dieselben Bakterien 2 Wochen später wieder im Uterus zu finden (E. coli Relatives Risiko (RR) = 3,7; T. pyogenes RR = 2,9). Kühe bei denen T. pyogenes isoliert wurde hatten zum entsprechenden Untersuchungstag ebenfalls ein erhöhtes Risiko mit mucopurulentem oder purulentem Ausfluss aufzufallen (Tag 10 ± 1: RR = 2,4, P < 0,001; Tag 24 ± 1: RR = 2,4, P < 0,001). Weiterhin wurden erhöhte Risiken für die Entstehung einer klinischen Endometritis an Tag 24 ± 1 pp gefunden, bei Kühen die 2 Wochen zuvor mit E. coli (RR = 1.7) oder T. pyogenes (RR = 1,7) infiziert waren. Selbige Kühe mit T. pyogenes hatten eine signifikant verlängerte Güstzeit (139 d, P < 0,05) im Vergleich zu Kühen ohne diese beiden Keime oder ohne E. coli . Tiere mit E. coli hingegen wiesen eine höhere Rastzeit auf (70 d, P < 0,001) und wurden zu einem größeren Teil ausgemerzt (15,8%, P < 0,05). Diese Ergebnisse zeigen, dass Kühe mit E. coli oder T. pyogenes im Uterus zu persistierenden Infektionen mit demselben Keim neigen und erhöhte Risiken für die Entstehung von klinischen Endometritiden bestehen. Infektionen mit alpha-hämolysierenden Streptokokken (AHS) zeigten nur an Tag 10 ± 1 pp ein erhöhtes Risiko für veränderten vaginalen Ausfluss. Weitere Untersuchungen zu seinen potentiell pathogenen Eigenschaften im Uterus sind nötig. Das Vorhandensein koagulase negativer Staphylokokken (KNS) hatte weder Einfluss auf den vaginalen Ausfluss noch auf Infektionen mit denselben oder anderen´Bakterien 2 Wochen später. In den meisten Studien, die sich mit der Bakterienflora des Uterus beschäftigen, werden Wattetupfer (Tu) zur Probenentnahme verwendet. Die Cytobrush (Cy) ist eine Technik aus der Humanmedizin, mit der Zellen aus dem Genitaltrakt entnommen werden, um Entzündungen Anhand der Anzahl von polymorph kernigen neutrophilen Leukozyten (PMNL) festzustellen. Diese Technik wurde für die Veterinärmedizin modifiziert und speziell für Rinder zur Diagnose der subklinischen Endometritis genutzt. Einige neuere Studien nutzten die Cytobrush zur Entnahme von Zellen und bakteriellen Proben, jedoch ohne Validierung. Daher war eine weitere Zielstellung meiner ersten Studie die Validierung der Cytobrush für die Entnahme von Bakterien und Zellen aus dem Uterus. In diesem Zusammenhang sollte auch die Übereinstimmung der bakteriellen Ergebnisse von 3 unterschiedlichen Laboren getestet werden. Hierfür wurde mittels einem doppelt umhüllten Einwegkatheter jeweils 5 ml Ausfluss von 68 Kühen an Tag 10 ± 1 pp aus dem Uterus entnommen und in sterile Plastikröhrchen übertragen. Von diesen Röhrchen wurden jeweils 1 Cytobrush und 1 Tupfer an die 3 Labore gesendet und die positiven oder negativen Ergebnisse von E. coli, T. pyogenes, AHS und CNS miteinander verglichen. Ein Labor erhielt immer eine zweite Tupferprobe der gleichen Kuh, um die Wiederholbarkeit innerhalb eines Labors zu untersuchen. Die Übereinstimmung der bakteriellen Ergebnisse war signifikant für Labor A + B und A + C für jede der beiden Probenentnahmemethoden (Labor A + B: Cy = 86%, Tu = 92%; Labor A + C: Cy = 82%, Tu = 86%). Die höchsten Übereinstimmungen hinsichtlich der Bakterienspezies wurden bei der Anzucht von E. coli erreicht (Labor A + B: Cy = 89.7%, Tu = 98.5%; Labor A + C: Cy = 82.4%, Tu = 88.2%). Die Übereinstimmungen innerhalb der Labore, zwischen den Cytobrush und Tupferproben waren ebenfalls signifikant (Labor A = 92%; Labor B = 97%; Labor C = 93%) genauso wie die Wiederholbarkeit der 2 Tupferproben von Labor A. Da es in dieser Studie keinen Goldstandard für den tatsächlichen Bakteriengehalt im Uterus gab, mit denen die Ergebnisse verglichen werden konnten, ist es nicht möglich eine Aussage darüber zu machen, welche Ergebnisse wirklich zutreffen. Jedoch belegen diese Ergebnisse, dass die Cytobrush sowohl für die Entnahme von Zellen als auch für bakterielle Proben verwendbar ist und somit gleichzeitig Informationen über den Entzündungs- und Infektionsstatus des Uterus gewonnen werden können. Die subklinische Endometritis kommt sehr häufig bei Milchrindern vor wobei die Ansätze, diese Erkrankung zu diagnostizieren sehr unterschiedlich sind. Alle Definitionen enthalten die Kriterien von unverändertem vaginalem Ausfluss und einer erhöhten prozentualen Anzahl von PMNL im Uterus. Jedoch unterscheiden sich die Angaben in den Grenzwerten für PMNL und dem Untersuchungszeitpunkt. Da diese Erkrankung einen nachgewiesenen negativen Einfluss auf die Fruchtbarkeit betroffener Kühe hat, war sie Teil verschiedener Studien in denen ein geringer BCS um den Abkalbezeitraum herum, Hyperketonaemie oder erhöhte Haptoglobinkonzentrationen im Blut als Risikofaktoren für die subklinische Endometritis identifiziert werden konnten. Das Ziel der zweiten Studie war die Untersuchung der Zusammenhänge zwischen bakteriellen Vorkommen von E. coli, T. pyogenes, AHS und CNS im Uterus von Milchrindern und der Anzahl an PMNL zum gleichen Zeitpunkt und 2 Wochen später. Zudem wurden 2 verschiedene Einteilungsschemata für unterschiedliche Prozente an PMNL zur Diagnose der subklinischen Endometritis miteinander verglichen. Von 149 Kühen wurden an Tag 10 ± 1 und 24 ± 1 pp bakteriologische und zytologische Proben mit der Cytobrush aus dem Uterus entnommen, wobei Tiere nur in die Studie aufgenommen wurden, wenn sie zur 2. Untersuchung keinen oder nur klaren vaginalen Ausfluss zeigten. Zusätzlich wurden weitere 131 Kühe zwischen 21 und 27 Tagen pp beprobt, welche auch keinen oder nur klaren vaginalen Ausfluss hatten. Der vaginale Ausfluss wurde mittels Vaginoskop bestimmt. Die Grenzwerte für PMNL im Uterus wurden bei 5, 10 und 18% gesetzt. Die Auswertung der Bakteriologie zeigte, dass Kühe mit AHS bei der ersten Untersuchung signifikant (P = 0,006) höhere Prozente an PMNL aufwiesen im Vergleich zu Kühen ohne diesen Keim. Zudem zeigten diese Tiere eine verlängerte Güstzeit (Hazard Ratio = 1,7; P = 0,038) und eine geringere Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Trächtigkeit nach 250 Tagen pp (Odds Ratio = 0,4; P = 0,022). Der Einfluss von anaeroben Bakterien kann hierbei nicht komplett ausgeschlossen werden, da diese nicht analysiert wurden. In vorhergehenden Studien konnte jedoch kein Zusammenhang zwischen anaeroben pathogenen Keimen (Fusobacterium necrophorum und Prevotella melaninogenica) im Uterus und dem prozentualen Anstieg von PMNL gefunden werden. Dies bestärkt den Verdacht von AHS als Risikofaktor für die subklinische Endometritis. Auch T. pyogenes erhöhte die Wahrscheinlichkeit dieselbe Kuh 2 Wochen später mit über 18% PMNL zu diagnostizieren. Da dieser Keim eine starke Schädigung des Endometriums hervorruft und als Wegbereiter für andere Bakterien das Immunsystem zusätzlich stimuliert, brauchen infizierte Kühe ohne Behandlung anscheinend eine längere Zeit, ehe sich das Endometrium wieder regeneriert hat. Keine der an Tag 24 ± 1 pp isolierten Bakterien (AHS, T. pyogenes, E. coli oder CNS) hatten zur gleichen Zeit einen Effekt auf die Anzahl an PMNL im Uterus. Um die verschiedenen Grenzwerte für die subklinische Endometritis zu vergleichen, wurden die Fruchtbarkeitsdaten aller Kühe von Tag 24 ± 1 und 21 – 27 pp analysiert. Dieselben Kühe wurden jeweils in den 2 festgelegten Schemata miteinander verglichen: PMNL1 (< 5, 5 – 18, > 18% PMNL) und PMNL2 (< 10, 10 – 18, > 18% PMNL). Die Fruchtbarkeitsdaten fielen jeweils in den mittleren Gruppen der 2 Schemata am besten aus, unterschieden sich aber in keinem Wert signifikant zu den Kühen mit < 5 bzw. < 10% oder > 18% PMNL. Bei der getrennten Betrachtung von primiparen und multiparen Kühen zeigten sich signifikante Unterschiede bei den Erstgenannten. Primipare Kühe der mittleren Gruppen wurden schneller wieder tragend (5 -18%: 68 d, P = 0,017; 10 – 18%: 70 d, P = 0,039) im Vergleich zu Kühen mit > 18% PMNL (144.5 d) und verhältnismäßig eher im Vergleich zu den Tieren mit < 5 bzw. < 10% PMNL (< 5%: 80d; < 10%: 77d). Bei den multiparen Kühen unterschieden sich die Fruchtbarkeitsdaten weder in der Aufteilung nach PMNL1 noch nach PMNL2. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Grenzwert von 18% PMNL einen hohen diagnostischen Wert, zumindest für primipare Kühe, besitzt, um sie zwischen 21 und 27 Tagen pp mit einer subklinischen Endometritis zu identifizieren. Die Ergebnisse dieser 2 Studien zeigten, dass Escherichia coli und Trueperella pyogenes wichtige Risikofaktoren für die Entstehung einer klinischen Endometritis sind. Zudem haben sich beide Keime negativ auf die Fruchtbarkeit der befallenen Kühe ausgewirkt. Ein Zusammenhang zwischen E. coli Infektionen und daraus folgenden Besiedelungen des Uterus mit T. pyogenes war auch mit meinen Daten zu belegen. Die subklinische Endometritis konnte auf die vorausgehende Infektion des Uterus T. pyogenes oder alpha-haemolysierenden Streptokokken zurück geführt werden. Da sich auch für Kühe mit AHS deutlich schlechtere Fruchtbarkeitskennzahlen ergaben, sollte die Pathogenität dieser Keime in anderen Studien nachgeprüft werden. Die bakteriologischen Ergebnisse der unterschiedlichen Labore stimmten sehr gut überein. Die sehr geringen Unterschiede zwischen Tupfer und Cytobrush belegen die Nutzbarkeit der Cytobrush für die Entnahme von Zell- und Bakterienproben aus dem Genitaltrakt.