Disturbance of blood brain barrier in the hippocampus and spreading depolarisation in a model of cortical stroke

Abstract

To maintain a specific neuronal environment mammalian brain vessels form a blood-brain-barrier (BBB) which comprises endothelial cells, pericytes, astrocytic endfeets, and neurons (Zlokovic et. al. 2008). The composition of the cerebrospinal fluid differs from that of blood and it has been argued that the precise regulation of the local ionic microenvironment around synapses is critical for the regulation of neuronal signalling (Abbot, Rönnbäk, Hansson 2006). The BBB is the major site for blood-cerebrospinal fluid exchange (Abbot, Rönnbäk, Hansson 2006). Stroke and other neurological diseases are associated with opening of the BBB, and its consequences are not yet known (Stoll et. al. 2009, Friedman A & Heinemann U). Stroke is a mortal disease and the survivors can show profound functional disabilities including post-stroke seizures and epilepsy. Thus, in this thesis I focus on the disturbance of the ionic microenvironment following BBB opening using ion-sensitive electrodes and acute hippocampal slice preparations obtained from rodents to study alterations in neuronal signalling. I used two approaches for mimicking the consequences of the opening of the BBB in the hippocampus. First approach was to expose in-vitro hippocampal slices to bovine serum albumin. Because I intended to mimic the ionic alteration occurring in the extracellular space during BBB opening, hippocampal slices were exposed to a solution containing the ionic concentration of serum ions of rodents. The delivery and exposure of albumin to the hippocampus in-vivo was also achieved using a single injection of bovine serum albumin into the brain ventricles. I compared these data to that obtained from acute hippocampal slices from animals which were sacrificed 24 hours after inducing a focal neocortical stroke using a photothombotic stroke model. These animals showed a massive BBB opening on the lesion side that affected also subcortical structures such as the hippocampus (opening BBB peak 12 hours after stroke). We observed often spontaneous SDs in acute hippocampal slices (n=8/10) prepared from the lesional side which were exposed to serum electrolytes 24 hours after photothrombotic stroke. Acute hippocampal slices prepared from naive animals 24 hours after intraventricular injection of albumin showed no spontaneous SDs, but a reeduced threshold for SDs using recurrent repetitive stimulation during serum electrolyte exposure (n=8/10) or normal cerebrospinal fluid (n=3/29). In-vitro exposure of albumin confirmed a reduced threshold for stimulus-induced SDs (≥ 10 Hz). Acute hippocampal slices after stroke or albumin exposure show that seizure like events are readily evoked by repetitive stimulation which transform into spreading depolarizations due to abnormal potassium accumulation. I conclude that opening of the blood brain barrier and the diffusion of albumin into non- necrotic tissue might play an important factor in the generation of peri- infarct depolarisations.

Um ein spezifisches neuronales Milieu zu ermögliche bilden zerebrale Gefäße eine Bluthirnschranke aus an der Endothelzellen, Astrozyten-Endfüße und Neurone beteiligt sind (Zlokovic et. al. 2008). Die Zusammensetzung der zerebrospinalen Flüssigkeit unterscheidet sich von der des Serums und es ist vorgeschlagen worden, dass die Zusammensetzung der zerebrospinalen Flüssigkeit um die synaptischen Kontakte kritisch für die Regulation normaler Signalprozesse im Gehirn ist (Abbot, Rönnbäk, Hansson 2006). Damit ist die Bluthirnschranke hauptsächlich für Austauschprozesse verantwortlich (Abbot, Rönnbäk, Hansson 2006). Schlaganfall und andere neurologische Erkrankungen sind häufig durch ein Öffnen der Bluthirnschranke gekennzeichnet, dessen Konsequenzen noch nicht vollständig verstanden sind (Stoll et. al. 2009, Friedman A & Heinemann U). Der Schlaganfall ist häufig tödlich und Überlebende weisen oft erhebliche Einschränkungen auf, wozu auch epileptische Anfälle nach dem Schlaganfall und eventuell eine spätere Epilepsie gehören. In meiner Doktorarbeit interessiere ich mich für die Störungen des ionalen Mileus nach Öffnung der Bluthirnschranke, wobei ich Messungen mit ionenselektiven Mikroelektroden und hippokampale Hirnschnittpräparate verwende. Um resultierende Veränderungen zu erfassen, verfolgte ich zwei Ansätze. Zum einen stellte ich Hirnschnitte her, nachdem die Tiere vor 24 Stunden eine intraventrikuläre Applikation von bovinen Serumalbumin erhalten hatten, zum anderen wurde akute Hirnschnittpräparate von naiven Ratten mit Albumin behandelt. Um die ionalen Veränderungen nachzuahmen wurden die Hirnschnitte mit einer Lösung behandelt, deren ionale Zusammensetzung der des Serums der Ratte entsprach. Ich habe diese Daten mit denen verglichen die an Hirnschnitten erhoben worden waren, die von Tieren gewonnen wurden, an denen 24 Stunden zuvor durch eine Photothrombose ein kortikaler Schlaganfall induziert wurde. Wir beobachteten eine ausgeprägte Öffnung der BHS an der Seite der photothrombotisch-induzierten Läsion. Die Öffnung der BHS war am stärksten 12 Stunden nach der Induktion des Schlaganfalles, welche den Neokortex sowie subkortikale Hirnstrukturen wie den Hippokampus mitbetroffen hat. Spontan auftretende SDs wurden oft (n=8/10) in hippokampalen Hirnschnittpräparaten der Läsionsseite beobachtet, die 24 Stunden nach der Induktion des Schlaganfall untersucht wurden, wobei eine künstliche Serumartige Lösung ohne Albuminzusatz verwendet wurde, deren Zusammensetzung der des Serums der Ratte entsprach. In Hirnschnitten die 24 h nach intraventrikulärer Albuminapplikation untersucht wurden traten keine spontanen SDs auf unabhängig davon, ob die Hirnschnitte mit künstlicher albumin-freien serumartigen Lösung oder mit künstlicher zerebrospinalen Lösung behandelt wurden. Es wurde hingegen keine spontane SDs bei hippokampalen Hirnschnitpräparaten beobachtet, die aus Tieren stammten, die mit einer intrazerebroventrikulären Applikation von Albumin 24 Stunden zuvor behandelt worden sind, gleichgültig ob die hippokampalen Hirnschnittpräparate mit künstlichem Liquor oder mit künstlichem ionalen Serum der Ratte behandelt wurden. Allerdings wurde eine abgesenkte Reizschwelle für die Induktion von SDs beobachtet, wenn die Hirnschnittpräparate mit künstlichem Liquor (n=3/29) sowie mit künstlichem Serum (n=8/10) behandelt wurden. Die direkte Applikation von Albumin in Hirnschnitpräparaten des Hippokampus in-vitro konnte eine erniedrigte Reizschwelle für die Induktion von SDs bestätigen, wenn Reizfrequenzen von 10 Hz und mehr verwendet wurden. In den aus vorbehandelten Tieren stammenden Hirnschnittpräparaten wurde oft nach repetitiver Reizung prägnante epileptische Nachentladung beobachtet aus denen die SD entstanden. Die epileptische Aktivität war mit abnorm großen Anstiegen der extrazellulären Kaliumkonzentration assoziiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Öffnung der BHS und die Diffusion vom Albumin in das peri-infarktöse Hirngewebe eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Peri-infarkt Depolarisationen spielt.