Structural and Biochemical Studies of Cotranslational Protein Transport across the Endoplasmic Reticulum

Abstract

The three dimensional structure of the non-translating 80S ribosome was determined using cryo-electron microscopy and single particle reconstruction. A 150 Angstroem long rod-shaped density at the 60S ribosomal subunit was identified as the main helix of extension segment 27 (ES27) and could be observed in two main positions: (i) close to the L1 arm (ii) or following a 90º turn, close to the exit site of the tunnel in the large ribosomal subunit. We propose that this rotating rRNA structure controls the access to the exit tunnel in the large ribosomal subunit for non-ribosomal factors, possibly interacting directly with the nascent chain or nascent chain interacting factors. The structure of the translating 80S ribosome in association with the protein conducting channel (PCC) was determined using cryo-electron microscopy and single particle reconstruction. The structure revealed four connections between the PCC and the ribosome formed by distinct rRNA and protein elements across a gap of 10-20 Angstroem. The observed closed conformation of the PCC was found to be independent of its functional state. Furthermore, it was estimated by transmembrane domain fitting that the oligomeric PCC is formed by three Sec61 alpha, -beta, and -gamma trimers. A model describing the cotranslational transport of proteins through the PCC and across the ER membrane and the integration of transmembrane proteins, proposes two main functional states of the ribosome-PCC complex. Using a fluorescent nucleotide exchange assay, we identified the beta-subunits of the two homologous trimeric PCCs in yeast to be the guanine nucleotide exchange factors (GEFs) for the beta-subunit of the signal recognition particle receptor involved in cotranslational protein transport across the membrane of the endoplasmic reticulum. Both the cytosolic domain of Sec61beta as well as the holo Sec61beta, when part of the isolated trimeric Sec61p complex, function as the GEF for SRbeta, whereas the same Sec61beta, when part of the heptameric complex that facilitates posttranslational protein transport, is inactive as the GEF for SRbeta.

Die dreidimensionale Struktur des nicht-translatierenden 80S Ribosoms wurde mit Hilfe von Kryo-Elektronenmikroskopie und 3D Rekonstruktion bestimmt. Eine 150 Angstroem Elektronendichte an der 60S Untereinheit des Ribosoms wurde als die Haupthelix des Erweiterungselements 27 (ES27) identifiziert und konnte in zwei Hauptpostionen beobachtet werden: (i) in der Nähe des L1 Armes (ii) und nach einer Rotation um 90º über dem Tunnelausgang der 60S Untereinheit. Wir postulieren ein Modell, in dem ES27 den Zugang von nicht ribosomalen Faktoren zum Tunnelausgang in der 60S Untereinheit kontrolliert und mit der neu- synthetisierten Polypeptidkette oder Proteinen interagiert die an die neu- synthetisierte Polypeptidkette binden. Die dreidimensionale Struktur des translatierenden 80S Ribosoms in Assoziation mit dem proteinleitenden Kanal wurde mit Hilfe von Kryo-Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion bestimmt. Die Struktur zeigt vier Brücken zwischen dem Kanal und dem Ribosom bestehend aus rRNA und ribosomalen Proteinen. Die Brücken verbinden den Kanal mit dem Ribosom über eine Entfernung von 10-20 Angstroem. Die beobachte geschlossene Konformation des Kanals ist unabhängig vom funktionalen Zustand des Ribosom- Kanalkomplexes. Das einpassen von Transmembrandomänen ergab, dass der proteinleitende Kanal wahrscheinlich aus drei Sec61-apha, -beta und -gamma- Trimeren gebildet wird. Wir postulieren ein Modell mit zwei funktionalen Hauptzustände für den Ribosom-Kanalkomplex, welches den Proteintransport durch den proteinleitenden Kanal sowie die Integration von Transmembranproteinen in die ER-Membran beschreibt. Mit Hilfe eines Fluoreszenz Nukleotidaustauschassays wurden die beiden beta-Untereinheiten der beiden homologen trimeren proteinleitenden Kanäle in Hefe als die Guanine-Nukleotid- Austausch-Faktoren (GEFs) für die beta-Untereinheit des Signalerkennungspartikelrezeptors (SRbeta) identifiziert. Sowohl die isolierte zytosolischen Domänen, als auch das gereinigte komplette Sec61beta, wenn im trimeren proteinleitenden Kanal assembliert sind funktional als GEFs für SRbeta. Ist Sec61beta dagegen im heptamären proteinleitenden Kanal assembliert, welcher in posttranslationalen Proteintransport involviert ist, ist es nicht als GEF für SRbeta aktiv.