Molekulare Mechanismen der glukoseabhängigen Regulation des neuronalen Zelltodes durch die Hexokinase II

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es die molekularen Mechanismen der neuroprotektiven Wirkung der Hexokinase II in einem in vitro Modell der zerebralen Ischämie zu untersuchen. Klassischerweise gehört die Hexokinase II (HKII) zu den vier Hexokinase Isoenzymen, die den ersten obligatorischen Schritt im Glukosestoffwechsel von Säugetieren katalysieren. Neben ihrer zentralen Rolle im Energiemetabolismus kommt der HKII eine funktionelle Bedeutung innerhalb der Apoptoseregulation zu. Zur Charakterisierung der neuroprotektiven Eigenschaften der HKII wurden Expressionsvektoren mit Punktmutationen in bereits bekannte, funktionell und strukturell wichtige HKII Domänen generiert, in eine primäre Neuronenkultur transfiziert und im Rahmen der kombinierten Sauerstoff- und Glukose-Deprivation (OGD) beziehungsweise reinen Sauerstoff-Deprivation (OD) oder Glukose-Deprivation (GD) auf ihre antiapoptotischen Effekte getestet. Die Ergebnisse demonstrieren die essentielle Bedeutung der mitochondrialen HKII-Bindung für die Vermittlung des neuronalen Zellschutzes im OGD-Modell, dargestellt durch die Aufhebung der protektiven Effekte bei Überexpression einer mitochondrialen Lokalisationssequenz defizienten HKII Mutante. Durch funktionelle Testung einer Akt-Phosphorylierungsdefizienten HKII Mutante und Akt-Phosphomimetischen HKII Mutante konnte eine apoptose-regulatorische Wirkung des HKII-Akt- Phosphorylierungsmotifs unter hypoxischen Bedingungen nachgewiesen werden. Der negative Effekt der HKII-BH-4 Domäne inaktivierten Mutante auf das Neuronenüberleben bestätigt die Funktionalität einer im C-Terminus des HKII Proteins postulierten HKII-BH-4 Domäne. In Zellkulturexperimenten mit einer katalytisch-inaktiven HKII Doppelmutante zeigte sich eine Glukoseabhängigkeit der antiapoptotischen Eigenschaften der HKII. Die katalytische Aktivität der HKII ist maßgeblich an der zellschützenden Wirkung des glykolytischen Enzyms beteiligt und macht die HKII zu einem interessanten Verknüpfungspunkt zwischen Zellmetabolismus und Apoptoseregulation. Durch die strukturell-funktionelle Charakterisierung der HKII-vermittelten Neuroprotektion erschließt sich ein besseres Verständnis der ablaufenden molekularen Mechanismen innerhalb der Apoptoseregulation. Diese Erkenntnisse bieten einen gezielteren Ansatz für die Identifizierung und Entwicklung von neuen Wirkstofftargets zur Therapie von neurodegenerativen- und Tumorerkrankungen. Da die HK neben ihrer ubiquitären Expression eine allgemein große Bedeutung für den Glukosemetabolismus in Säugetierzellen hat, könnten die nachgewiesenen funktionell- wichtigen HKII Domänen auch über neuronale Zellen hinaus relevant sein und beispielsweise zur Therapieoptimierung bei einem Myokardinfarkt beitragen.

Hexokinase II (HKII) is one of 4 mammalian Hexokinase isoenzymes catalyzing the first obligatory step of glucose metabolism. In addition to their catalytical activity, HKII is also believed to play a role in regulating cell death. In the state of ischemic tolerance Hexokinase II is upregulated by Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1). In order to investigate the role of HKII in neuroprotective signaling, site directed mutagenesis was used to generate several murine HKII expression vectors with mutations in domains relevant for glucose metabolism and apoptosis regulation. The effect of HKII and its mutants on neuronal survival was studied using a sensitive technique based on co-transfecting embryonic rat primary cortical neurons with eGFP (green cells) and HKII or HKII mutant vectors. These co-transfected cells were co-cultivated with primary neurons expressing m-orange (orange cells) and subsequently submitted to an in vitro model of cerebral ischemia (oxygen-glucose- deprivation, OGD), (glucose-deprivation, GD) or (oxygen-deprivation, OD), respectively. The ratio of green vs. orange neurons before and after the damaging event was analysed. Thereby the effect of different HKII mutants on neuronal survival could be determined. The data demonstrates that mitochondrial binding of HKII is a dynamic and adaptive response mediated by protein kinase B (PKB)/Akt kinase dependent phosphorylation, that protects neurons from OGD induced apoptosis. It is proposed that HKII may serve as a molecular switch regulating apoptosis in a glucose concentration depending fashion and may those provide a link between cellular metabolism and survival. These results might also have a therapeutic implication for vascualar diseases like stroke.