Pflanzliche Sekundärprodukte als Inhibitoren von ausgewählten Verdauungsenzymen

Abstract

Übergewicht und Adipositas sind Hauptrisikofaktoren für die Entstehung chronischer Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes mellitus Typ 2. Seit 1980 hat sich die Zahl der Menschen, die an Adipositas erkrankt sind, weltweit mehr als verdoppelt, sodass die Gesellschaft vor einer immer größer werdenden Herausforderung bezüglich Prävention und Behandlung steht. Unterstützend zu einer diätetischen und bewegungstherapeutischen Behandlung liegt ein innovativer Therapieansatz in der Entwicklung von Inhibitoren der Nährstoffhydrolyse und -resorption. Insbesondere durch eine Hemmung wichtiger Enzyme und Transporter des Kohlenhydrat- und Lipidstoffwechsels sollen postprandiale Triglycerid- und Glucose-Spiegel im Blut reduziert werden. Zunächst erfolgte die Entwicklung und Etablierung fluorezenzbasierter Screening-Assays zur Bestimmung der Aktivität essentieller Enzyme des Verdauungssystems. Es konnten insgesamt fünf verschiedene Testsysteme optimiert werden. Dazu zählen die Aktivitätsbestimmung der Pankreaslipase, der pankreatischen \alpha-Amylase, der intestinalen \alpha-Glucosidase, der intestinalen Alkalischen Phosphatase und der Pankreasproteasen. Im Anschluss wurden 23 überwiegend polyphenolische Reinstoffe hinsichtlich einer Aktivitätshemmung der Enzyme analysiert und Struktur-Wirkungs-Beziehungen der Flavonoid-Strukturen abgeleitet. Es konnten Strukturmerkmale identifiziert werden, welche eine Inhibition des jeweiligen Enzyms verstärken oder verringern. Dabei zeigten vor allem die Anzahl und die Position phenolischer Hydroxylgruppen sowie gebundene Zucker einen Einfluss auf die Enzymhemmung. Weiterhin wurden wässrige und methanolische Extrakte von 60 Pflanzen der Traditionellen Chinesischen Medizin und der Traditionellen Europäischen Medizin auf eine Inhibition der Pankreaslipase und \alpha-Amylase getestet. Die Pflanze Hibiscus sabdariffa L. (Malvaceae) zeigte eine sehr starke Inhibition der analysierten Verdauungsenzyme und wurde anschließend mittels HPLC und ESI-Q-TOF-MS zur Identifikation inhibitorisch wirksamer Inhaltsstoffe näher analysiert. Es konnten die Verbindungen Hibiskussäure und Hibiskussäure- Glucosid eindeutig als aktive Komponenten identifiziert werden. Ein in silico Docking von Hibiskussäure an die Kristallstruktur der Schweinepankreaslipase (PDB-Code: 1ETH) zeigte starke Interaktionen mit dem aktiven Zentrum des Enzyms. Ebenfalls zeigte der methanolische Extrakt von Crataegus pinnatifida Bge. var. major N.E.Br. (Rosaceae) eine starke Inhibition der enzymatischen Aktivität. Auf Grundlage dieser Beobachtungen folgten im Anschluss tierexperimentelle Untersuchungen zum Einfluss dieses Extraktes auf die Nüchternblutglucose- und Serumlipidkonzentration (Triglyceride, Gesamtcholesterin) im Diabetes mellitus Typ 2-Rattenmodell. Durch die Behandlung konnte eine signifikante Reduzierung der Blutglucose- und Serumlipid-Konzentration erreicht werden. Auf Grundlage der experimentell ermittelten IC50 Werte zur Inhibition der Pankreaslipase sowie weiterer Literaturdaten erfolgte die Entwicklung von 3D-Pharmakophormodellen für ein virtuelles Naturstoffscreening. Es konnten 68 potentiell inhibitorische Verbindungen der Pankreaslipase identifiziert und die Wirksamkeit ausgewählter Verbindungen unter experimentellen Bedingungen getestet werden. Sieben von acht der untersuchten Naturstoffe sowie elf Pflanzenextrakte wurden als Inhibitoren der Pankreaslipase identifiziert. Untersuchungen zum Einfluss von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen und Pflanzenextrakten auf die intestinale Glucoseaufnahme wurden ebenfalls durchgeführt. Dazu wurde zunächst ein fluoreszenzbasiertes Glucose-Aufnahme Assay im CaCo-2 Zellsystem entwickelt und etabliert. Es wurden insgesamt 19 Reinstoffe und sieben wässrige Pflanzenextrakte analysiert, die jedoch nur einen geringen Einfluss zeigten.

Overweight and obesity are leading risc factors for a number of chronic diseases such as diabetes mellitus type 2. Since 1980, the number of people suffering from obesity has more than doubled and prevention and treatment are becoming a major challenge for our society. Supported by dietary and exercise therapies, an innovative therapeutic approach includes the development of inhibitors of nutrient digestion and absorption. In particular, the inhibition of essential enzymes and transporters of the carbohydrate and lipid metabolism is an attractive target for lowering postprandial triglyceride and glucose levels in the blood. Fluorescence-based screening assays for the determination of the activity of essential enzymes of the digestive system were developed and established in a first stage. A total of five different systems were optimized for activity determination of pancreatic lipase, pancreatic \alpha- amylase, intestinal \alpha-glucosidase, intestinal alkaline phosphatase, and pancreatic proteases. Subsequently, 23 mainly polyphenolic substances were analyzed for enzymatic inhibition and structure-activity relationships of the flavonoid structures were derived. Structural features were identified and recorded to amplify or reduce inhibition of the respective enzyme. In particular, the number and position of phenolic hydroxyl groups as well as bound sugar residues had an influence on enzyme inhibition. In addition to enzymatic inhibition experiments of pure compounds, aqueous and methanolic extracts from 60 plants of Traditional Chinese Medicine and Traditional European Medicine were tested for anti-lipase and anti-amylase activity. The plant Hibiscus sabdariffa L. (Malvaceae) showed a very strong inhibition and was subsequently analyzed by HPLC and ESI-Q-TOF-MS for identification of active compounds. Hibiscus acid and hibiscus acid glucoside were identified. In silico docking experiments of hibiscus acid to the crystal structure of porcine pancreatic lipase (PDB code: 1ETH) showed strong interactions with the active site of the enzyme. The methanolic extract of Crataegus pinnatifida Bge. var. major N.E.Br. (Rosaceae) also showed a strong inhibition of the enzymatic activities. Therefore, animal experiments were conducted to analyze the effect on fasting blood glucose and serum lipid levels (triglycerides, total cholesterol) using a type 2 diabetes rat model. The treatment resulted in a significant reduction of blood glucose and serum lipid concentrations. In order to predict the binding mode of pancreatic lipase inhibitors from in vitro testing and further literature data, 3D pharmacophore models were created. By subsequent virtual screening of natural product libraries, 68 hits predicted to possess inhibitory activity towards the enzyme were identified. The efficacy of selected compounds was then tested under experimental conditions. Seven out of eight virtual screening hits as well as eleven plant extracts were identified as pancreatic lipase inhibitors. Studies on the influence of secondary metabolites and plant extracts on intestinal glucose uptake were carried out. First, a fluorescence-based glucose uptake assay was developed and established in a CaCo-2 cell system. A total of 19 compounds and seven aqueous plant extracts were analyzed, but showed only slight effects.