Untersuchungen zum Eisenmetabolismus während der megakaryozytären Differenzierung und Proliferation der K562-Zellen

Abstract

Frühe Stadien der Megakaryopoiese, die im Knochenmark zur Bildung von Megakaryozyten führen, können auch in-vitro studiert werden, indem man die erythroleukämische Zelllinie K562 mit dem Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) stimuliert. Dies führte zur Zunahme der megakaryozytären Eigenschaften dieser Zellen, was anhand der Zellmorphologie und der Expressionszunahme des megakaryozytären Markers CD 41/61 festgestellt wurde. Gleichzeitig wurde die Abnahme der erythroiden Eigenschaften anhand der reduzierten Expression des erythroiden Markers -Globin und die Zunahme der Acetylcholin- esteraseaktivität beobachtet. Die megakaryozytäre Differenzierung der K562-Zellen war von der umfangreichen Reorganisation des intrazellulären Eisenmetabolismus begleitet. K562-Zellen, die im eisenfreien Medium differenzierten, besaßen nach 72 Stunden einen signifikant höheren absoluten Eisengehalt als Kontrollzellen, die unter diesen Bedingungen proliferierten. Das zeigt, dass in K562-Zellen während der In-vitro-Megakaryopoiese Eisenakkumulation stattfindet. Die Ursache dafür lag in der Abnahme der Eisenfreisetzung, mit der die Expressionsreduktion von Transkripten des Eisenexporters Ferroportin (Fpn1) korrelierte. Der Einbau der akkumulierten Eisenionen in Hämoglobinmoleküle resultierte in der Zunahme des absoluten Hämoglobingehalts. Wegen der differenzierungsbedingten Zunahme der Proteinsynthese wurde aber die Abnahme des relativen Hämoglobingehalts (Hb: Protein Verhältnisses) festgestellt. Unter Bedingungen der erhöhten Eisenverfügbarkeit (Eisenammoniumcitrat im Zellkulturmedium) konnte der reduzierte Hämoglobingehalt in differenzierenden K562-Zellen kompensiert werden, was auf die Eisenabhängigkeit des Prozesses der Reduktion der erythroiden Eigenschaften hinweist. Die Differenzierung war ebenfalls begleitet durch die Reduktion der transferrinabhängigen Eisenaufnahme. Das wurde in Experimenten nachgewiesen, in denen K562-Zellen während der PMA- Behandlung oder Proliferation mit 4 mg/ml Ferritransferrin beladen wurden. Die Reduktion der Aufnahme von Ferritransferrin war durch die Expressionsabnahme von Transferrinrezeptor-1 (TfR1) begleitet, welches für die Internalisierung von Transferrineisen verantwortlich ist. Gleichzeitig wurde die modulierte Expressionszunahme von Hämochromatoseprotein HFE festgestellt, das die Internalisierung von TfR1-Tf-Komplexen behindert. Die Experimente mit Beladung der K562-Zellen mit 100 µM Eisenammoniumcitrat während der PMA-Behandlung oder Proliferation ergaben, dass in differenzierenden Zellen der posttranskriptionale, eisenabhängige Feedback-Mechanismus der Expressionsegulation der TfR1-Transkripte durch die eisenunabhängige, transkriptionale Regulation ersetzt wurde. Auf RNA-Ebene wurde auch die Expressionsreduktion des TfR2 festgestellt, der neben dem TfR1 in die transferrinabhängige Eisenaufnahme involviert ist, sowie die Expressionsabnahme der Transkripte der Isoformen A und B vom divalent metal transporter-1 (DMT1), die entsprechend für die transferrinunabhängie Eisenaufnahme und den Transport von Eisenionen aus dem Lumen der endozytotischen Vesikel ins Cytoplasma verantwortlich sind. Da in differenzierenden Zellen die Eisenregulierbarkeit der H-Ferritin-mRNA festgestellt wurde, spiegelt die Expressionsuppression dieser Transkripte gleichzeitig die Konzentrationsabnahme der freien, cytoplasmatischen Eisenionen (labile iron pool) wider. Die 72-stündige PMA-Behandlung der K562-Zellen führte auch zur Expressionsreduktion der Präprohepcidin-mRNA. Die stabile Überexpression der Präprohepcidin-cDNA in K562-Zellen beeinflusste den Eisenmetabolismus dieser Zellen kaum, was anhand der unveränderten Expression der TfR1-Transkripte festgestellt wurde. Die endogene Präprohepcidin-mRNA- Expression war in Präprohepcidin-cDNA-Transfektanten unterdrückt, was ein Hinweis für die Autoregulation der Hepcidinexpression in erythroiden Zellen darstellt.

Early steps of megakaryopoiesis of primary bone marrow cells can be investigated in vitro by treatment of erythroleukemic cell line K562 with phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA). Differentiation process was successfully verified by morphological properties, increased expression of the megakaryocytic marker CD41/61 and the increase of acetylcholinesterase activity. Reduktion of erythroid properties was verified by decreased expression of the erythroid marker γ–globin. PMA-induced megakaryocytic differentiation of 562 cells was accompanied by the remodeling of cellular iron metabolism. Incubation of K562 cells in iron free medium with PMA resulted after 72 hours in significant increase of total iron content, in relation to proliferating K562 cells. This iron accumulation during PMA- treatment was caused by block of iron release and correlated with strong reduction of expression of iron exporter ferroportin (Fpn1). The increase of total iron levels was accompanied by the increase of total haemoglobin content, indicating not only increase of haemoglobin synthesis, but also incorporation of accumulated iron into haemoglobin molecules. The increased rate of protein synthesis and enlargement of the cytosolic compartment due to the differentiation process resulted under low iron conditions in loss of increase of the iron-to-protein ratio. Increase of iron availability (FAC in cell culture medium) restored low haemoglobin-to-protein ratios in differentiated cells to levels observed in proliferating cells, providing evidence that loss of erythroid characteristics during megakaryocytic differentiation represents an iron-dependent process. Experiments with incubation of K562 cells with 4 mg/ml ferritransferin (ferri-Tf) during in vitro megakaryopoiesis or proliferation showed significant reduction of transferrin-dependent iron uptake in differentiated cells. In relation to this result reduction of expression of transferrin receptor 1 and 2 (TfR1 and 2), modulated increase of expression of haemochromatosis protein (HFE) and reduced expression of isoform B of divalent metal transporter-1 (DMT1) were observed at protein or RNA level. Studies with 48 hours of iron overload with 100 M ferric ammonium citrate (FAC) during PMA-treatment or proliferation of K562 cells provided evidence that during megakaryocytic differentiation steady- state levels of TfR1 transcripts were downregulated independent of iron by transcriptional mechanism. Reduced expression of isoform A of DMT1 was also observed, implicating reduction of non- Tf iron uptake. The iron independent downregulation of ferritin heavy chain mRNA in differentiating cells reflects the reduction of labile iron pool (LIP) during this process. 72 hours of PMA- treatment resulted in strong reduction of pre-pro-hepcidin-mRNA expression. K562 cells, which overexpressed the pre-pro-hepcidin cDNA, showed unaffected steady-state levels of TfR1 transcripts, implicating unchanged cellular iron metabolism in these cells. On the other hand, overexpression of pre-pro- hepcidin cDNA in K562 cells resulted in reduction of expression of endogenous pre-pro-hepcidin transcripts, which suggests an autocrine regulation of hepcidin expression in erythroid cells.