Rekombinante Adeno-assoziierte Viren zur Expression des µ-Opioid-Rezeptors in neuronalen Zellen

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Optimierung einer durch rekombinante Adeno-assozierte Viren (rAAV) vermittelten spezifischen Expression des µ-Opioid-Rezeptors (µ-OR) in neuronalen Zellen. Für die Expression von µ-OR wurden Kombinationen verschiedener Promotoren sowie alternativer Vektortypen (einzelsträngig vs. doppelsträngig) konstruiert und in nicht-neuronalen und neuronalen Zellen auf Expression getestet. Die übergeordnete Zielstellung für die in vivo Applikation besteht dabei in der lokalen Erhöhung der µ-Opioid-Rezeptordichte an den Endigungen peripherer Nerven. Dies würde zu einer selektiven Verstärkung der peripheren Opioidanalgesie bei gleichzeitiger Vermeidung von Nebenwirkungen der Opioide im zentralen Nervensystem führen. Es wurden zunächst verschiedene Promotoren für die µ-OR Expression im Kontext einzelsträngiger (ss) rAAV-Vektor-Plasmide verglichen: die Enhancer/Promotor-Region des IE1-Gens des humanen Cytomegalievirus (CMV), der CMV-chicken-ß-Actin Hybridpromotor (CBA) und der Promotor der Neuronen-spezifischen Enolase (NSE). Im Kontext eines selbstkomplementären (sc) rAAV-Vektors konnte aus Gründen der maximalen Verpackungsgröße nur der CMV-Promotor eingesetzt werden. Nach Transfektion nicht-neuronaler und neuronaler Zelllinien konnte mit den entsprechenden Plasmid-Konstrukten eine µ-OR Expression nachgewiesen werden, wobei die Expression durch den stark neuronen-spezifischen NSE-Promotor nur in differenzierten neuronalen Zellen nachweisbar war. Alle Vektorkonstrukte konnten als rekombinante AAV-Vektoren verpackt werden. Die Viruspräparationen wurden über Dichtegradientenzentrifugation und anschließender Affinitätschromatographie hochgereinigt. Dabei wurden Virustiter im Bereich von 1 x 1010 bis 1 x 1011 genomischen Partikel pro ml erreicht. Bei der Testung der µOR-rAAV Vektoren nach Infektion in Zellkultur konnte eine Expression von µ-OR in Immunoblot-Analysen nachgewiesen werden. In Bindungsversuchen mit radioaktiv markierten Liganden für µ-OR wurde die korrekte Lokalisation und Funktionalität der rekombinant exprimierten µ -Opioid-Rezeptoren an der Oberfläche der infizierten Zellen nachgewiesen. Das im Rahmen der Doktorarbeit hergestellten Panel an rAAV-Vektoren bietet sich je nach Fragestellung für eine zelltyp-unabhängige, breite (CMV- oder CBA- Promoter) oder selektiv neuronen-spezifische (NSE-Promoter) Expression des µ-OR an. Ein klarer Fortschritt für die Applikation in vivo ist die Konstruktion eines selbstkomplementären AAV-Vektors, da diese sich gegenüber einzelsträngigen AAV-Vektoren durch eine schneller einsetzende und insgesamt höhere Transgenexpression auszeichnen. Alle hergestellten Konstrukte stehen der funktionellen Untersuchung im Tiermodell zur Verfügung. Bei selektiver Infektion schmerzweiterleitender Hinterwurzelneurone des Rückenmarks wird erwartet, dass der µ-OR nach Expression in der Nervenperipherie durch Bindung von Agonisten (z.B. Morphin) seine schmerzhemmende Wirkung entfalten kann. Vor allem chronische Schmerzpatienten, bei denen ein längerfristig notwendiger Einsatz von Opioiden durch die erheblichen, zentralen Nebenwirkungen limitiert ist, könnten in Zukunft von diesem gentherapeutischen Ansatz profitieren.

The topic of this work was the optimisation of recombinant adeno-associated virus (rAAV) mediated µ-opioid receptor (µ-OR) expression in neuronal cell lines. Combinations of different promoters and AAV vector types (single- stranded vs. self-complementary) were constructed and µ-OR expression was tested in non-neuronal and neuronal cell lines. The study aims at up- regulation of µ-opioid receptors in peripheral nerve terminals in vivo. This selective local increase is assumed to potentiate the antinoceptive effects of opioid analgetics, thus avoiding undesired systemic side effects. First, different promoters were compared in the context of the single-stranded (ss) AAV-vector design: The immediate-early promoter-enhancer region of human cytomegalovirus (CMV), the CMV-chicken-ß-actin hybrid promoter (CBA) and the neuron-specific enolase promoter (NSE). In the context of self-complementary (sc) AAV vectors only the CMV promoter could be used due to the limited overall packaging size. Transfection of non-neuronal and neuronal cells led to detectable µ-OR expression for all AAV vector constructs; the expression driven by neuron-specific NSE-promoter, however, was restricted to differentiated neuronal cells. Highly purified rAAV vector stocks were produced and purified by density-gradient centrifugation and affinity chromatography. Vector titers of 1 x 1010 to 1 x 1011 genomic particles per ml could be achieved. Immunoblot analysis detected µ-OR expression upon AAV vector transduction in cell culture. The correct localisation and functionality of µ-OR on the cell surface of rAAV-infected cells could be demonsrated in a binding study with a specific radioactively-labelled ligand. The µ-OR expressing AAV vectors generated here can be applied either for cell- type-independent, ubiquitous (CMV- or CBA-promoter) or for restricted, neuron- specific (NSE-Promoter) expression of µ-OR. A major achievement for high-level µ-OR expressing is the construction of a self-complementary AAV vector. These show faster onset and superior gene expression in vivo compared to ss-AAV vectors. The newly constructed µ-OR expressing AAV-vectors are available for functional analysis in animal models. Upon selective infection of primary afferent neurons of the spinal cord, the µ-opioid receptors can execute their analgesic effects by enhanced binding of agonists (e.g. morphine) at the sensory nerve terminals. The approach is especially helpful in patients with chronic pain who depend on long-term treatment with opioids. Since dose escalation of the drugs is limited because of severe side effects, these patients would especially profit from a gene therapeutic approach of site- specific receptor enhancement.